miR-375、miR-146a及miR-21在慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌患者中表達及其對肝癌的診斷意義

昝麗娜 孫峰 張永娟 張靜

(亳州市人民醫院檢驗中心，安徽 亳州 236800)

慢性乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)是臨床常見的一種可通過血液、體液接觸而傳播的疾病〔1〕。肝硬化是一種肝損害疾病，臨床表現為壓痛、肝功能減退、黃疸、腹脹、黑便及腹水等，其病程緩慢并伴有各種并發癥，如消化道出血、肝性腦病及肝腎綜合征等，當進入失代償階段時易發生癌變，從而進展為肝癌〔2,3〕。肝癌在人類惡性腫瘤中可排前3位，是肝細胞或膽管細胞發生惡性病變所致。肝癌的發病率及死亡率均較高，嚴重威脅人類的生命健康〔4〕。肝癌的發病與乙肝、肝硬化均有著密切關系，肝癌的高發生率一部分原因是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致〔5〕。由于缺乏早期有效的診斷，大部分肝癌患者一旦發現就處于中晚期，錯過最佳手術時機，導致患者預后較差〔6〕。因此尋找靈敏度高、特異度好的肝癌標志物是目前醫學研究的熱點。HBV-DNA、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(GGT)和堿性磷酸酶(ALP)是常規的實驗室檢測項目，而miRNA是一種調節基因表達關鍵的因子，研究證實，其在肝癌的發生及發展中起到十分重要的作用〔7〕。miRNA在血漿中可穩定存在，可通過檢測患者血清的方式對其表達情況進行觀察。本研究通過對慢性乙肝患者、肝硬化患者及肝癌患者實驗室常規項目及血清中miRNA(miR)-375、miR-146a及miR-21表達進行檢測，以期為肝癌的早期診斷提供依據和新的研究方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年2月毫州市人民醫院收治的43例慢性乙肝患者納入慢性乙肝組，36例肝硬化患者納入肝硬化組，31例肝癌患者納入肝癌組，慢性乙肝患組男29例，女14例，平均年齡(58.85±7.89)歲；肝硬化組男25例，女11例，平均年齡(59.13±7.65)歲；肝癌男21例，女10例，平均年齡(63.22±7.93)歲；3組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，有可比性。納入標準：①符合慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的診斷標準〔8～10〕；②病例資料完整；③簽署知情同意書；排除標準：①伴有精神類疾病；②合并心腦腎等重要器官障礙者；③其他惡性腫瘤患者。

1.2方法

1.2.1相關儀器及試劑 實驗主要儀器為：全自動生化分析儀(美國貝克曼)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀(上海宏石)、離心機(上海強生醫療器材有限公司)、S100型PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)、水浴鍋(常州諾基儀器有限公司)、垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)、Tanon 1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；主要試劑：裂解液(德國Qiagen公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、反轉錄試劑盒(日本Takara公司)、Taqman microRNA 探針(美國Applied Biosystems公司)。

1.2.2樣本采集 采集3組外周靜脈血(禁食8 h)5 ml，20℃下靜置30 min，離心機2 500 r/min離心10 min，取上清，5 000 r/min離心10 min，檢測HBV-DNA、ALT、AST、GGT和ALP，其余血清置入-80℃冰箱備存，用于miR-375、miR-146a及miR-21的批量檢測。

1.2.3miR-375、miR-146a及miR-21檢測 采用qRT-PCR技術檢測miR-375、miR-146a及miR-21的表達：①取出樣本并進行解凍；②按照Trizol試劑的說明書提取組織總RNA(純度比值范圍控制：1.8～2.0)；③標記microRNA，并進行miRNA芯片雜交，并掃描及數據分析；④選取miRNA芯片結果中的miR-375、miR-146a及miR-21進行熒光定PCR分析：采用反轉錄試劑盒配置反應混合物，反轉錄合成環狀DNA；RT-PCR反應條件：95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，40個循環，相關引物序列由上海生工公司提供，每個樣品目的基因的CT值用內參基因(U6RNA)來進行歸一化，獲得實驗樣品和對照樣品的△CT值，目的基因相對U6的表達量=2-△CT，最后計算miR-375、miR-146a及miR-21相對表達量2-△△CT。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行F檢驗、χ2檢驗、受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結 果

2.13組血清HBV-DNA陽性率比較 肝硬化組血清HBV-DNA陽性率〔23例(63.89%)〕明顯低于慢性乙肝組〔39例(90.70%)〕和肝癌組〔28例(90.32%)〕，差異均有統計學意義(χ2=11.57，P<0.05)；慢性乙肝組血清HBV-DNA陽性率與肝癌組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.23組血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較 3組血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)，肝癌組血清ALT、AST水平明顯低于慢性乙肝患者，血清ALP水平明顯高于慢性乙肝組(P<0.05)；肝癌組血清GGT水平明顯高于慢性乙肝組和肝硬化組(P<0.05)。見表1。

表1 3組血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較

2.33組血清miR-375、miR-146a及miR-21表達情況 miR-146a及miR-21在慢性乙肝組、肝硬化組及肝癌組血清中的水平呈現顯著增高趨勢，miR-375表達則呈現顯著下調趨勢(P<0.05)，見表2。

表2 3組miR-375、miR-146a及miR-21表達情況

2.4miR-375、miR-146a及miR-21對肝癌診斷情況 miR-375、miR-146a及miR-21三者聯合對肝癌的診斷效能明顯優于使用單一指標(P<0.05)，見表3，圖1。

表3 miR-375、miR-146a及miR-21對肝癌診斷情況分析

圖1 miR-375、miR-146a及miR-21對肝癌的診斷價值

3 討 論

全球范圍內有超過3.5億的慢性乙肝患者，每年約60萬慢性乙肝患者發生死亡，慢性乙肝是導致肝硬化及肝癌的重要原因〔11〕。慢性乙肝的發病機制十分復雜，目前仍不能完全闡述清晰，其可能與凋亡相同基因、自身免疫及肝炎病毒等多種因素作用有關〔12〕。慢性乙肝具有經久不愈及反復發作的特點，隨著病情的發展，大量肝細胞凋亡，肝功能障礙嚴重，易導致肝纖維化，進行形成肝硬化〔13〕。通常肝硬化的起病較隱匿，病程較長，可持續3～10年〔14〕。當慢性乙肝患者的肝細胞發生彌漫性壞死、肝臟出現纖維性增生，則基本上可判斷進入早期肝硬化，隨著肝硬化的病程進展，若不及時治療，患者肝功能損害加重、膠原會明顯增多，并于竇狀間隙內各處過度沉積，并演變成毛細血管，發生大量物質交換，發生纖維化及結節狀再生，極易發生癌變〔15〕。

血清HBV-DNA、ALT、AST、GGT和ALP的水平是常規實驗室檢測項目，多年來用于慢性乙肝、肝硬化和肝癌患者的臨床診斷和治療。本研究結果說明對于HBV-DNA水平一直較高的乙肝患者，在其明顯下降的時候，一定要提防病程的進展，而肝硬化患者如果出現血清HBV-DNA水平的突然增高，要及時排除肝癌的可能。本研究結果發現ALT、AST、ALP、GGT等酶的改變對于判斷慢性乙肝患者的疾病進程均有一定的輔助作用。焦嬌等〔16〕指出，HBV-DNA水平及血清酶的改變是慢性乙肝和肝硬化患者發展為肝癌的危險因素。

miRNA屬于一種調節基因表達關鍵的因子，可調節多個，乃至數百個靶基因，參與自身免疫疾病發生及發展過程，在機體免疫系統發育、免疫應答及自身免疫中起重要作用〔17〕。miRNA不僅會參與人體細胞生長和分化的生理過程，還可參與炎癥及癌變等病理過程。研究證實，miRNA參與了肝細胞生長、病毒感染、應激反應及肝表型的維持等，可反映肝細胞及組織水平的基礎生理狀態，在肝癌的發生及發展中起到重要作用〔18〕。miR-146a會對炎性反應產生負反饋調節的作用，可監測自身免疫性疾病病情的活動性〔19〕。miR-375最早是在胰島β細胞中被發現，其可調控胰島素的形成及分泌，大量研究發現，miR375在腫瘤組織中會呈現低表達〔20〕。miR-21是一種研究最早也是較特殊的miRNA，在細胞增殖、分化及凋亡過程中發揮重要作用。研究顯示，在消化系統腫瘤(胰腺癌、胃癌及肝癌等)中miR-21表達均上調〔21〕。本研究結果究其原因為miR-146a可誘導產生大量炎癥因子，加重患者的炎癥反應，使患者的肝臟受累程度加重。miR-21會誘導上皮間質轉化，促進肝硬化發生，并可作為一種原癌基因，促進肝癌細胞的分化及生長，并增強其侵襲與轉移，從而在肝癌患者體內的表達呈異常上調。

目前對肝癌的診斷主要通過影像學及病理檢測，但難免存在較高的漏診，尤其對早期肝癌的診斷率并不高。miRNA可通過形成脂蛋白復合物的形式抵抗RNA酶降解，可在血液中相對穩定存在，可通過反復提純而檢測到，減少入侵性的檢查，其檢測快捷、簡單而有效，適合臨床上對肝癌的早期篩查。本研究結果說明聯合檢測血清miR-375、miR-146a及miR-21表達情況，可作為肝癌，尤其對于乙肝肝硬化背景的肝癌的理想診斷標志物。