H3K27M和Ki-67在小兒腦膠質瘤中的表達及相關性

胡歷博 劉偉 朱晉 柴毅 張玉琪

腦膠質瘤在顱內原發性腫瘤中占比最高[1]。腫瘤復發對膠質瘤治療效果影響最大，可能與腫瘤干細胞遷移有關，盡管目前嘗試了一些新的治療手段，但惡性膠質瘤患者的預后仍較差[2-3]。隨著分子生物學的發展，靶向藥物可能導致膠質瘤的治療效果取得突破性進展[4]。2016年WHO中樞神經系統腫瘤分類將H3K27M 突變型彌漫性中線膠質瘤作為一個單獨的類型，該病多見于兒童[5]。H3K27M突變型彌漫性中線膠質瘤是一種高侵襲性惡性腫瘤，多由組蛋白H3F3A 基因突變導致，形態多為星形細胞瘤樣[6]。Zhao等[7]報道Ki-67在細胞周期的活動期被檢測到，可用以評價腫瘤增殖程度。本研究采用免疫組織化學檢測小兒腦膠質瘤組織中H3K27M和Ki-67的表達情況，分析其與組織分級、預后等臨床指標的關系及探究此兩項的表達是否具有相關性，以期為膠質瘤的發生發展研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2013年11月至2018年6月清華大學玉泉醫院手術切除并保存完整的人腦膠質細胞瘤標本38例，經病理診斷為腦膠質瘤。其中男性21例（55.3%），女性17例（44.7%）；年齡8個月至14歲，平均年齡5.6歲，＜3歲8例（21.1%），≥3歲30例（78.9%）。病例均有完整臨床、影像學和病理資料，并進行隨訪。根據患者術前MRI及術中實際情況將發病部位分為腦干及非腦干部位，其中腦干部位8例，非腦干部位（小腦半球、松果體區、海馬區等部位）30例。按2016年WHO中樞神經系統腫瘤分級標準進行組織學分類與分級，其中Ⅰ級15例（39.5%），Ⅱ級14例（36.8%），Ⅲ級0例，Ⅳ級9例（23.7%）。節細胞膠質瘤13例，星形膠質瘤14例，少突膠質細胞瘤1例，室管膜瘤1例，膠質母細胞瘤9例。同時將其分為低級別組（Ⅰ～Ⅱ級）29例，高級別組（Ⅲ～Ⅳ級）9例。選取10例癲癇患者正常腦組織標本作為對照組。所有患兒均無類風濕、糖尿病、甲狀腺功能亢進等其他疾病。本研究獲醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 H3K27M 兔單克隆抗體（ZA-0321）和Ki-67鼠單克隆抗體（ZM-0166）均購自北京中杉金橋生物公司。將標本用福爾馬林固定、石蠟包埋處理后常規切片制成厚3 μm切片，經烘干、二甲苯脫蠟后用檸檬酸緩沖液高壓修復抗原，3%雙氧水消除內源性過氧化物酶，加一抗孵育，過夜后沖洗，滴加二抗，常規DAB 顯色，蘇木精復染等。所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 結果判定 免疫組織化學判斷標準：每張病理切片隨機選取5個（×100）視野，H3K27M屬于組蛋白類型，鏡下觀察到細胞核呈現棕黃色細顆粒狀物質沉積反應，為H3K27M 細胞核陽性反應；Ki-67染色表現為細胞核染色為主，鏡下觀察到細胞核呈現淺黃色至棕褐色則為陽性表現，計算5個高倍鏡視野內陽性細胞占比，以≤30%為低標記指數，＞30%為高標記指數[8]。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，正常腦組織及人腦膠質瘤組織中表達陽性率的差異采用χ2或Fisher 精確檢驗，應用Spearman 秩相關分析H3K27M和Ki-67 在膠質瘤組織中表達水平的相關性。生存時間指病理確診至患者死亡或最后隨訪時間。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 H3K27M、Ki-67 在小兒腦膠質瘤及正常腦組織中的表達

本研究免疫組織化學結果顯示，H3K27M在小兒腦膠質瘤組織中的陽性率為34.2%（13/38）。組織分級中，H3K27M在高級別膠質瘤中的陽性率為77.8%（7/9），低級別膠質瘤中的陽性率為20.7%（6/29）。性別分組中，男性陽性表達率為38.1%（8/21），女性陽性表達率為29.4%（5/17）。年齡分組中，幼兒組（＜3歲）中的陽性表達率為12.5%（1/8），兒童組（≥3歲）中的陽性表達率為40.0%（12/30）。腫瘤部位組中，腦干部位陽性率為62.5%（5/8），非腦干部位的陽性率為26.7%（8/30）。

經Spearman 秩相關分析（表1），H3K27M 陽性表達與性別、年齡、腫瘤部位無顯著相關性（P＞0.05），與病理級別有顯著相關性（P＜0.05）。H3K27M 在正常腦組織中未見表達，38例人膠質瘤中13例表達，陽性表達率為34.2%（13/38），差異有統計學意義（χ2=4.69，P＜0.05）。H3K27M在低級別膠質瘤中陽性率為20.7（6/29），在高級別膠質瘤中陽性表達率為77.8%（7/9），差異有統計學意義（χ2=9.95，P＜0.05）。

在小兒腦膠質瘤組織中Ki-67的陽性率為100%（38/38），其中Ki-67高標記指數為13.2%（5/38），低標記指數為86.8%（33/38）。組織分級中，高級別膠質瘤中的Ki-67高標記指數為55.6%（5/9），低級別膠質瘤中的高標記指數為0（0/29）。性別分組中，男性Ki-67高標記指數為14.3%（3/21），女性高標記指數為11.8%（2/17）。年齡分組中，幼兒組中的Ki-67高標記指數為12.5%（1/8），兒童組中的高標記指數為13.3%（4/30）。腫瘤部位組中，腦干部位組中的Ki-67高標記指數為37.5%（3/8），非腦干部位組中的高標記指數為6.7%（2/30）。經Spearman秩相關分析（表1），Ki-67高標記指數與性別、年齡無顯著相關性（P＞0.05），與病理級別、腫瘤部位有關（P＜0.05）。Ki-67在正常腦組織中未見表達，在38例人膠質瘤中均表達，陽性表達率為100%，差異有統計學意義（χ2=48.0，P＜0.05）。Ki-67在低級別膠質瘤中的高標記指數為0（0/29），在高級別膠質瘤中的高標記指數為55.6%（5/9），差異有統計學意義（χ2=18.55，P＜0.05）。免疫組織化學結果見圖1。

表1 H3K27M陽性表達、Ki-67高標記指數與膠質瘤患者各臨床指標間的關系例（%）

2.2 Kaplan-Meier生存曲線分析

截至2019年3月，平均隨訪時間為871 天（30個月）。Kaplan-Meier 生存曲線分析結果表明性別、年齡、手術方式與患兒生存時間之間無明顯關聯；病理分級、腫瘤部位、H3K27M蛋白陽性、Ki-67高標記指數與患兒生存時間之間有明顯關聯（P＜0.001，P=0.002，P=0.005，P＜0.001，圖2）。

2.3 膠質瘤中H3K27M、Ki-67表達的相關性

應用Spearman秩相關分析顯示，H3K27M、Ki-67蛋白表達在膠質瘤組織中具有相關性（r=0.376，P=0.02，表2）。

圖1 H3K27M、Ki-67免疫組織化學結果（免疫組化一步法×100）

圖2 Kaplan-Meier法分析病理分級、腫瘤部位、H3K27M陽性表達、Ki-67高標記指數與患兒生存時間相關性

表2 H3K27M、Ki-67蛋白高標記指數在腦膠質瘤組織中的表達例

3 討論

顱內膠質瘤是腦腫瘤中發病率最高且預后最差的腫瘤，可起源于神經膠質、室管膜、脈絡叢上皮等，依據其所在部位及病理類型不同，病程時間不一。本組38例無WHOⅢ級膠質瘤，可能因本組小兒腦膠質瘤病例數量相對較少的緣故。腦膠質瘤可發生于顳葉、額葉、松果體區、基底節區、腦干等部位，本組病例中發生于腦干21.1%。H3K27M蛋白屬于組蛋白類型，有多種變體，分為5種亞基，分別為H1、H2A、H2B、H3和H4，H3K27M 組蛋白H3.3 特定位點的突變導致編碼氨基酸的改變，該機制與中線膠質瘤的發生密切相關[9-11]。Hochart 等[12]研究發現兒童中線結構膠質瘤中，H3K27M突變與患兒的預后具有顯著的相關性。采用手術切除腫瘤組織后予以放化療等傳統治療方式治療伴H3K27M 突變的彌漫性中線膠質瘤患兒，預后較差，2年生存率低于10%。目前主要采取檢測腦脊液中腫瘤細胞DNA組蛋白H3.3的基因突變情況對療效進行評估[13-14]。

本研究同樣發現高級別膠質瘤組中的H3K27M蛋白陽性表達率明顯高于低級別膠質瘤組，生存時間中位數明顯偏低，且H3K27M在正常腦組織中未見表達，在38例人膠質瘤中13例陽性表達，陽性表達率為34.2%，差異有統計學意義，說明H3K27M蛋白能在一定程度上反映小兒膠質瘤病變程度。Ki-67細胞在G0期不表達，進入G1期開始表達，在M期表達最強，能反映細胞核增殖活性[15]。Bai 等[16]報道Ki-67在正常腦組織中不表達，在膠質瘤細胞中異常高表達，且Ki-67標記指數與惡性程度呈正相關。本研究結果也表明Ki-67蛋白表達水平隨膠質瘤病理分級的增高而顯著增高，且Ki-67在正常腦組織中未見表達，在38例人膠質瘤中38例陽性表達，陽性表達率為100%，差異有統計學意義，說明Ki-67的表達與膠質瘤的發生、發展有關，Ki-67高標記指數是預后不良的標志。Spearman 相關性分析顯示在本組病例中H3K27M、Ki-67 在小兒腦膠質瘤表達具有相關性，結合相關文獻推測可能有以下原因：1）H3K27M突變致瘤性主要涉及組蛋白去甲基化修飾；2）Ki-67是由MKI67 基因編碼的一種核蛋白抗原，主要反映腫瘤增殖率，兩者在膠質瘤起源中可能涉及相同的調控機制，有待進一步研究證實。

目前膠質瘤的治療方法多主張手術及術后輔助放化療，但效果仍不理想，一些新的治療方式正在研究中。張作鑫等[17]使用RNAi 技術在膠質母細胞瘤細胞系中敲低PLK4表達后，發現腫瘤細胞的體外增殖能力明顯減弱。化療治療對小兒膠質瘤仍具有重要意義，將替莫唑胺與生物靶向藥物聯用是近年研究熱點之一[18]。本研究考慮到化療過程中仍有血液、神經毒性等不良反應發生，對小兒發育可能有不利影響，僅7例患兒進行了術后化療，化療方案包括環磷酰胺+依托泊苷+順鉑、順鉑+依托泊苷、長春新堿+卡鉑、替莫唑胺等，但是化療組與非化療組之間患兒的生存率無顯著性差異，可能與病例數相對較少、缺乏規范化療有關，仍需擴大病例樣本進一步研究。

綜上，本研究對小兒腦膠質瘤中H3K27M、Ki-67的表達進行研究并分析其與膠質瘤的病理分級、預后的關聯，表明小兒腦膠質瘤中H3K27M、Ki-67的表達水平對小兒腦膠質瘤的病理分級、預后具有提示意義，且H3K27M、Ki-67蛋白表達在膠質瘤組織中具有相關性，為研究膠質瘤的發生發展及靶向治療提供了線索。綜合本研究及文獻報道提示，下一步將進一步研究H3K27M的甲基化狀態是否與神經干細胞的多能性調節有關、膠質瘤組織中TGF-β1表達水平是否影響Ki-67的表達水平從而影響膠質瘤的良惡性程度、運用RNAi 技術能否阻斷Ki-67 基因在膠質瘤中的表達等，期望能減輕膠質瘤患兒的痛苦，減少其家庭和社會的負擔。