兔舌癌細胞系建立及生物學特性檢測*

于化蛟 王 姝 金武龍

舌癌是最常見、發病率最高的頭頸惡性腫瘤，近年來，其發病率仍不斷上升，每年全世界范圍內有近300000 新增病例[1]。舌癌患者5 年生存率為50%～60%[2-4]，無頸淋巴結轉移的患者3 年生存率為77.7%，而有頸淋巴結轉移的患者3 年生存率為41.12%，頸淋巴結有無轉移是舌癌預后的重要影響因素[5-7]。舌癌患者術后會出現吞咽障礙、言語障礙等，嚴重影響生活質量。盡管如此，人們對舌癌的生物學特性的了解卻很少。以人本身作為實驗對象在實踐上受到很多限制，借助于舌癌細胞系及動物模型的間接研究，有助于更方便、更有效地認識舌癌發生、發展規律，研究診治和防范措施。

本研究意義在于建立一個能夠穩定傳代的新兔舌癌細胞系，為舌癌生理、病理、臨床治療、新藥篩選等提供具有免疫力的大動物模型，搭建了一個新的生物技術平臺，完整再現舌癌生物學特性。

1.材料與方法

1.2 方法

1.2.1 兔舌癌動物模型建立 取第55 代對數期的RSCC-1，以5×107個細胞注射入純種新西蘭白兔舌緣，2 周后成瘤，建立兔舌癌模型(圖1)。成瘤后取下瘤體組織，行病理檢測。

圖1 兔舌癌模型

1.2.2 采用Transwell Permeable Supports(TPS)法進行原代培養 取瘤體組織放入無菌生理鹽水中清洗、浸泡，在無菌玻璃皿內將腫物剪成約3mm3大小組織塊。將小組織塊放入Transwell 小室內。六孔板內加入含20%胎牛血清的DMEM 培養基，于37℃，5%CO2細胞培養箱內培養，隔天更換培養基。20 天后，可見六孔板壁長滿細胞，主要為腫瘤細胞，其間摻雜血細胞及成纖維細胞。使用貼壁法與酶消化法相結合的方法進行細胞純化。

1.2.3 細胞檢測 顯微鏡觀察舌癌細胞的生長狀態、形態。

免疫細胞化學染色：將細胞接種于放有蓋玻片(經賴氨酸處理)的6 孔板內，待細胞長到80%以上融合時，經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用丙酮甲醇混合液固定，做常規HE 染色及細胞角蛋白免疫組化染色。

MTT 法測定細胞生長曲線：胰酶消化對數生長期RSCC-1a，離心，以含10%胎牛血清的DMEM培養基制成5-10×104/mL 細胞懸液。取七個96孔板，邊緣孔無菌PBS 液填充，將細胞懸液吹打均勻，每孔內加入200μL，6 個重復，以PBS 為空白對照孔，培養7 天。每天取一個板并給6 個孔內加入MTT 溶液，37℃培養4h，棄上清，每孔加入DMSO 150μL，振蕩機震蕩5min，使藍紫色結晶物充分溶解，選擇492nm 波長，在酶聯免疫儀上測定各孔波長吸光度(A)的差值，以培養時間為橫軸，A 值為縱軸，連續7 天測得值繪制生長曲線。

計算細胞群體倍增時間：根據公式：DT=T×lg2/lg(Nt/N0)計算，其中T 為培養時間，N0為首次記錄的細胞數，Nt為t 時間后的細胞數。

細胞周期檢測：胰酶消化對數生長期的RSCC-1a，置于離心管中，1000r/min 離心5min，預冷的PBS 液洗滌，4℃預冷的70%乙醇-20℃固定過夜，固定細胞，1000rpm 離心3min，棄上清，加入遇冷PBS1000rpm 離心3min，棄上清，預冷PBS 懸浮細胞，加5-10μL RNase A(10mg/mL)酶在37℃水浴鍋中消化30min，過400 目細胞篩，注入EP 管，封口膜封口，將細胞放入流式管，加PI 一滴，上樣。

為了提高管理實效，鄉鎮水利工程管理需要構建管理責任制。首先，管理責任制能夠約束員工的行為，保障水利工程穩定運行。為了提高管理制度的合理性，需要按照水利工程施工標準和鄉鎮地區對水利工程設施的應用需求構建相關制度。管理人員應當了解同一地區水利工程所應用的管理制度，將其中的優點融入到管理工作中，從而提高管理制度的科學性，提升鄉鎮水利工程管理水平。其次，為了提高員工對管理責任制的重視程度，管理人員應當將獎懲制度融入管理制度。提高檢查力度，推動工程管理良性發展，為鄉鎮地區經濟發展奠定良性的基礎。

染色體數目分析：第13 代RSCC-1a 秋水仙素同步化,Giemsa1 染色法顯示染色體，取50 個細胞計染色體數，油鏡下觀察記錄染色體。

1.2.4 成瘤率檢測 消化收集第15 代RSCC1a，制成1×107個/mL 細胞懸液，在4～6 周齡BALB/C-nu 裸鼠后腿皮下注射0.2mL，共十只，雌雄各五只，體重為150g-200g，觀察成瘤情況。(批號：scxk 京-2012-0001)

新西蘭白兔6 只，雌雄各3 只，體重1.5～2.0kg，取第17 代兔舌癌細胞，制成5×107個細胞懸液0.7ml，注射入新西蘭白兔兔舌緣，觀察成瘤情況。

2.結果

2.1 兔舌癌動物模型瘤體組織病理檢測 兔舌癌動物模型瘤體組織病理檢測，HE 染色見癌細胞呈圓形，細胞核大、胞質少、核漿比失調，癌細胞位于舌肌間，免疫組化染色角蛋白陽性，透射電鏡下見癌細胞間有橋粒、半橋粒連接，細胞表面有微絨毛，胞漿內有張力原纖維，符合鱗癌特征(圖2)。

2.2 原代培養結果 原代培養第4 天后可見組織塊周圍有細胞爬出，1 周后組織塊周圍有較多細胞團塊，六孔板底部亦可見較多貼壁細胞，形狀極不規則。2 周后可見六孔板底部長滿細胞，可見大量排列整齊的成纖維細胞，以及形狀不規則的腫瘤細胞(圖3)。經過純化，原代細胞繼續傳代培養，第3 代后，成纖維細胞幾乎消失，只剩腫瘤細胞。獲得較為純凈的兔舌癌細胞(如圖4)。獲得得兔舌癌細胞每4～5 天傳代一次，目前已傳至73 代。

圖3 成纖維細胞與腫瘤細胞(100×)

圖4 兔舌癌細胞(100×)

2.3 細胞相關檢測 在倒置相差顯微鏡下RSCC-1a 排列成鋪磚狀，有失接觸抑制、堆積生長等特性，貼壁細胞呈不規則梭形或多邊形，核大，雙核或多核。電鏡下見細胞膜表面有長短不一的微絨毛，細胞間可見橋粒連接，胞漿內見張力原纖維。免疫組化染色胞漿細胞角蛋白陽性，Vimentin表達陰性，表明該細胞系為上皮來源惡性腫瘤(圖5～圖7)。

圖5 倒置相差顯微鏡下舌癌細胞呈鋪路狀排列(100×)

圖6 高倍鏡下見貼壁細胞形狀不規則，核大(200×)

圖7 兔舌癌細胞不同染色

MTT 法測定細胞生長曲線，見兔舌癌細胞第4～7 天處于對數生長期，第8 天進入緩慢生長期。(圖8)。按公式計算出細胞倍增時間為38.67h。

圖8 細胞生長曲線圖

流式細胞儀分析RSCC-1a 細胞周期，處于G1 期占71.55%，G2 期占6.59%，S 期20.84%(圖9)。

圖9 舌癌細胞周期圖

染色體數目分析：兔舌癌細胞系染色體數為93～212 之間，眾數為139。正常新西蘭白兔染色體2n＝44 條，該細胞系染色體主要分布在102～176 之間，占92%，因此該細胞系為一個多倍體核型(圖10)。

圖10 細胞染色體數目分析圖(1000×)

2.4 成瘤率檢測 10 只實驗裸鼠注射兔舌癌細胞后第5 天，第一只裸鼠成瘤，至2 周時，10 只裸鼠后腿皮下均成瘤。RSCC-1a 異種(裸鼠)成瘤率為100%。

6 只實驗新西蘭白兔兔舌緣注射RSCC-1a 后，出現漏食，嘴周毛臟亂，精神狀況較注射前變差等癥狀，進食及飲水量均減少，4 周后6 只實驗新西蘭白兔兔舌緣均形成腫物，其中2 只發生同側頸部淋巴結轉移，1 只發生肺轉移，RSCC-1a 同種異體(兔)成瘤率100%(圖11～圖16)。

圖11 舌腫瘤

圖12 頸淋巴結轉移

圖13 舌癌肺轉移

圖14 舌腫瘤病理片(100×)

圖15 淋巴結轉移病理片(100×)

圖16 肺轉移病理片(100×)

3.討論

舌癌是最為常見的頭頸惡性腫瘤之一，舌體血供豐富，淋巴引流亦十分豐富，且是活動器官，易發生區域淋巴結轉移，易復發，也常常出現遠隔器官轉移，預后差。舌癌會破壞患者的語言、咀嚼等正常生理功能，嚴重影響患者身心健康和生活質量[8]。目前舌癌的主要治療手段仍以手術、放療、化療為基礎的綜合序列治療[9]。

為了研究舌癌的生物學特性，國內的何榮根等人在1981 年建立了國內的第一株舌癌細胞系：人舌癌鱗狀細胞癌細胞系Tca-8113[10]，Tatake 等人于1990 年建立了人舌鱗癌細胞系AW13516 和Awaw8507[11]，Okumura 等人在1996年建立了SAS[1]，Kawashiri 等人在2001 年建立了人舌癌頸淋巴轉移細胞系OSC219[12]，此外，還建立了很多舌癌動物模型。這些細胞系的建立和動物模型的建立，促進了舌癌的基礎研究和臨床研究。但是這些細胞系基本都是人舌鱗狀細胞癌細胞系，動物模型也大多數為小鼠等小動物模型，無法建立舌癌頸淋巴轉移模型，而兔的頸部淋巴結區域引流與人類頸部淋巴結分布極其相似[13]。金武龍等[14-15]動物模型及兔舌癌細胞系RSCC-1，在傳代過程中出現了生物學特性丟失情況。本實驗經過RSCC-1 細胞懸液注入兔舌緣，建立兔舌癌動物模型，后經原代培養、細胞純化，得到RSCC-1a，顯微鏡下觀察，見細胞異型性明顯，單層貼壁生長，有堆積性生長等特點，CK 陽性，符合上皮源性惡性腫瘤細胞特點。生長曲線表明細胞從第4 天進入對數生長期，細胞數在第8 天達到高峰。細胞周期分析結果表明，細胞處于G1 期及S 期較多，細胞群體增值較慢。裸鼠成瘤率、同種異體成瘤率均為100%，染色體分析表明其為一個多倍體核型，符合惡性腫瘤細胞特征。

以往的研究中表明已建立的細胞系有被交叉污染或錯誤辨識的可能，使用這樣的細胞系進行相關實驗研究，會出現錯誤的結論以及結果不可重復等嚴重后果，這將浪費大量時間、精力和金錢。2010 年美國典型培養物保藏中心標準開發工作組(American Type Culture Collection Standards Development Organization Workgroup ASN-0002)在Nature Reviews Cancer 發表文章，提出以STR作為人源細胞身份認證的金標準[16]。STR(Short Tandem Repeat，短串聯重復序列)基因位點由長度為3～7 個堿基對的短串連重復序列組成[17]，這些重復序列廣泛存在于人類基因組中，可作為高度多態性標記。由于核心序列及重復次數不同，使STR 在不同種族、不同人群之間的分布具有很大的差異性，從而構成了STR 的遺傳多態性。這種遺傳多態性使得STR 分型可以用于個體身份的識別[18]。

本文目前建立了一個能夠穩定傳代的新兔舌癌細胞系RSCC-1a，為舌癌生理、病理、臨床治療、新藥篩選等提供具有免疫力的大動物模型，搭建了一個新的生物技術平臺，完整再現舌癌生物學特性，即不僅模擬原發灶的臨床表現，且可以發生區域性淋巴結、遠隔器官轉移。該細胞系目前已傳至73 代，細胞系的形態學、生長動力學、生物學性狀基本符合上皮惡性腫瘤細胞系的特征。但是，該細胞系在以后的傳代中，是否會出現生物學特性丟失情況，還需進一步深入研究，在后續的實驗中，將會選出凍存的不同代數細胞，提取基因組DNA，使用STR 分型鑒定，來進一步證明其身份。