陽離子型聚氨基酸的抑菌性能與生物安全性能的研究*

楊 坤 欒 波 馬 楠 劉 可 劉 軍 劉 娜 顧 斌 張 維

口腔微環境是一個共生功能體，口腔正常菌群之間以及它們與宿主之間相互依存，共同構成了動態平衡的口腔生態系[1]。牙體、牙周、黏膜、頜面部組織，甚至種植體常常出現感染性疾病會打破這種平衡。研究發現，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)[2]和大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)等可引起口腔頜面部感染[3,4]，變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)[5]和伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa)等致病菌是導致齲病[6,7]和牙周病[8]發生的主要原因。近年來，抗生素(如四環素)常常用來預防和治療因細菌感染引起的牙齦炎、牙周炎、口腔潰瘍、拔牙和種植體術后創面感染等問題。眾所周知，長時間使用抗生素會引起細菌耐藥性和生物安全性問題[9]，尤其不適用于糖尿病等慢性病患者。然而，當前市面上并沒有替代藥物或醫療器械可用。研究表明，抗菌多肽和ε-聚-L-賴氨酸具有殺菌能力強，抑菌譜廣，安全性高[10,11]及不產生耐藥性等特點，抗菌肽制成的藥物對牙周炎治療效果顯著，但其穩定性，生產成本及安全性問題還有待于研究及摸索[12,13],ε-聚-L-賴氨酸的合成機理及抑菌機制尚未揭示清楚，阻礙其在醫學領域廣泛應用，因此本文旨在合成一種具有優異生物安全性能的陽離子型聚氨基酸(Cationic polyamino acid，CPAA)，分子鏈中含有堿性氨基酸，通過分子鏈中大量氨基與細菌作用，達到抑制主要口腔致病菌的效果，減少抗生素等抗菌藥物在口腔細菌感染領域的應用。

1.材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 (1)昆明小鼠(SPF 級)和黃金地鼠(SPF 級)由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，試驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006，動物質量合格證編號：11400700368604、1100111911 022806；(2)豚鼠(普通級)由北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司提供，試驗動物生產許可證號：SCXK(京)2015-0005，動物合格證編號：11804800014706。

1.1.2 主要試劑與實驗儀器 羥乙基纖維素(美國陶氏，藥典)、厭氧工作站(Gene Science，E200)、超凈工作臺、生化培養箱(上海森信實驗儀器有限公司，SHP-250 型)、高壓蒸汽滅菌鍋、核磁1H-NMR(布魯克公司)、凝膠滲透色譜(Agilent Technologies，1260)。

1.2 實驗菌株 本實驗使用的金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌ATCC 25922、變形鏈球菌ATCC 25175、牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277、伴放線放線桿菌ATCC 29523 由中國科學院理化技術研究所抗菌檢測中心提供。

1.3 陽離子型聚氨基酸(CPAA)的制備

(1)N(ε)-芐氧羧基-L-賴氨酸環內酸酐(N(ε)-Carbobenzoxy-L-lysine N-Carboxyanhydride，NCA)合成：N(ε)-芐氧羰基-L-賴氨酸(Lys(Z))懸浮于四氫呋喃(Tetrahydrofuran,THF)，50℃密閉條件下與三光氣反應，生成Lys(Z)-NCA(a)[14]，采用同樣法在60℃下生成纈氨酸-NCA(b)；(2)聚合反應：利用六甲基二硅氮烷(Hexamethyldisilazane，HMDS)可控活性引發聚合的特性[15,16]，開環聚合合成共聚物c，具體反應過程為在25℃通氮氣，將HMDS 加入到含a 的DMF 溶液中，反應3 d 后加入含b 的DMF 溶液，接著反應3 d后再次加入含a 的DMF 溶液，繼續反應3 d 后用甲基叔丁醚析出產物c；(4)脫保護基：將c 溶解于三氟乙酸，25℃下加入HBr/乙酸溶液反應1～3 h，得到產物d；(5)純化：用離子交換樹脂純化產物d，最終獲得陽離子型聚氨基酸CPAA 材料e(圖1)。

圖1 陽離子型聚氨基酸CPPA 合成路線圖

1.4 抑菌性能評價

1.4.1 測試樣品制備 CPPA 溶液：將CPPA懸于滅菌水中，配制成所需濃度的CPPA 溶液；CPPA 凝膠：將CPPA 溶液中加入羥乙基纖維素(增稠劑，已通過美國藥典)，配制成含量為0.1%w/w CPPA 凝膠(CPPA 含量，實際應用中的含量)。

1.4.2 最小抑菌濃度(MIC) 采用固體培養基稀釋法，將不同濃度的CPPA 溶液加于融化后冷卻至45 ℃的定量瓊脂培養基中，混合均勻，傾注平板，瓊脂凝固后即為含不同濃度CPPA 的培養基。分別接種2 μL 107CFU/mL 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于瓊脂培養基中，恒溫培養24 h，觀察待測菌的生長情況。

1.4.3 CPPA 凝膠抑菌性能 參考GB 15979-2002《一次性使用衛生用品衛生標準》附錄C4 對CPPA 凝膠的抑菌性能進行測試。取0.6 mL CPPA凝膠，將其涂在平皿底部2 cm×3 cm 區域，取0.1 mL 濃度約為105CFU/mL 的菌液(測試菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌)，接種作用時間為2、5、10 和20 min。到時間后，加入4.3 mL PBS 進行中止，再分別進行逐級稀釋，針對不同接觸時間的試液，在不同梯度進行平板活菌計數，得各試液的活菌濃度，抑菌率按公式計算。

抑菌率=(原菌數-活菌數)/(原菌數)×100%

1.5 安全性毒理學評價

1.5.1 細胞毒性試驗 參照16886.5 醫療器械生物學評價體外細胞毒性試驗，取生長旺盛的L929，用胰蛋白酶消化成細胞懸液后，調節細胞密度至1×105個細胞/mL，將配置好的細胞懸液接種于96 孔培養板，分別設陰性對照組和實驗組，每組各設6 孔，每孔接種100 μL 細胞懸液，然后將96 孔板放置于5%CO2培養箱37 ℃培養24 h后，棄去原培養液。陰性對照組加入細胞培養溶液。實驗組加入試驗樣品浸提液，每孔100 μL，置于37 ℃5%CO2培養箱中繼續培養24 h，更換培養液后，將96 孔板放置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，然后每孔加入質量濃度為1 mg/mL 的MTT溶液50 μL，繼續培養2 h 后，棄去孔內液體，每孔加入100 μL 異丙醇溶液，震蕩平板，在酶標儀570 nm 波長下測定吸光度OD 值(參考650 nm)，計算相對增殖率(relative growth rate，RGR，RGR=實驗組OD 值/陰性對照組OD 值×100%)。

1.5.2 急性經口毒性試驗 參照消毒技術規范(2002 版)2.3.1 急性經口毒性試驗進行試驗。先進行預實驗，以CPPA 溶液5000、4000、2000 和1000 mg/kg 劑量分組進行預實驗給藥，找出其粗略致死劑量范圍，然后再設計正式試驗的劑量分組。

主試驗：昆明小鼠，雌性各半，隨機分組，每組10 只。采用灌胃方式將受試物一次給予動物。染毒后觀察動物的中毒表現和死亡數及死亡時間，并對死亡動物和觀察期滿處死動物進行尸體解剖，肉眼觀察，發現有異常的組織或臟器，尚需進一步作組織病理學檢查。觀察時間14d。

1.5.3 皮膚變態反應——豚鼠最大劑量試驗豚鼠，每組動物數10 只，雌雄各半。參照GB 7919-1987 化妝品安全性評價程序和方法3.1.2.3皮膚變態反應試驗中豚鼠最大劑量試驗進行。實驗組受試物為0.1%w/w CPPA 凝膠。第一次致敏：陰性、陽性對照組和實驗組分別注射0.1 mL 對應的樣品，如圖2 所示；二次誘導：注射后第8 天，在2 cm×4 cm 紗布上涂上適當賦形劑配制的受試物，將其貼在注射部位，持續封閉固定48 h。對照組：僅用賦形劑注射；激發接觸：末次致敏后14 d，分別用2 cm×2 cm 的濾紙涂抹受試物，再次貼敷在兩側去毛區，持續封閉和固定24 h。激發接觸后24、48 和72 h 后，觀察反應，并對其進行皮膚反應強度評分。

圖2 最大劑量致敏試驗注射位點示意圖

1.5.4 口腔黏膜刺激試驗 健康金黃色地鼠，每組動物數3 只。參照16886.10 刺激與皮膚致敏試驗。翻轉地鼠頰囊用生理鹽水沖洗后，無異常，用棉球浸透樣品(0.1%w/w CPPA 凝膠)，放入動物的一側頰囊內，另一側頰囊含生理鹽水的棉球作為陰性對照。接觸時間10 min，接觸后除去項圈和棉球，用生理鹽水沖洗頰囊(不要污染另一側頰囊)。每小時重復上述步驟，共4 h。取出棉球后肉眼觀察頰囊，按記分系統判定動物每一觀察期頰囊表面紅斑反應記分。末次接觸后24 h 肉眼觀察頰囊，無痛處死地鼠。取頰囊有代表性部位的組織樣品，放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，厚度5 mm，HE 染色，光鏡下觀察黏膜組織是否有病理改變。

1.6 統計學分析 采用SPSS14.0 軟件對數據進行統計學分析。P＜0.05 表示具有統計學差異。

2.結果

2.1 陽離子型聚氨基酸CPPA 通過陰離子聚合方法成功制得陽離子型聚氨基酸CPPA，并對其進行1H-NMR 測試。結果如圖3 所示：以D2O 為溶劑，δ 0.80-0.86(-CH3)，δ 1.38-1.62(-CH2-)，δ 2.93-2.94(-CH2-)，δ 4.24(-CH-)。圖3 中1-3位置有6 個H(賴氨酸支鏈)和5-6 位置上有6 個H(纈氨酸支鏈)，賴氨酸與纈氨酸結構單元的峰面積比3.68∶1；4 位置上有2 個H(賴氨酸支鏈)和5-6 位置上有6 個H(纈氨酸支鏈)，賴氨酸與纈氨酸結構單元的峰面積比3.66∶1。因此我們獲得CPPA 為([C6H12ON2·HCl]3.67[C5H9ON])n。通過GPC 測試，以水為流動相，得到Mn(數均分子量)=7574 g/mol，PD=1.095，n 約為11。

圖3 陽離子型聚氨基酸CPPA 及其核磁氫譜

2.2 抑菌性能

2.2.1 CPPA 的最小抑菌濃度 采用瓊脂稀釋法[17]，對1000、500、250、125、62.5 μg/mL 5 個濃度梯度的CPPA 的抑菌性能進行試驗。從圖4 看出CPPA 對條件性致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)值的范圍為500～1000μg/mL。

圖4 含不同濃度CPPA 瓊脂對細菌生長的影響

2.2.2 CPPA 凝膠的抑菌性能 將0.1%w/w CPPA 凝膠分別與含不同菌株的菌液作用考察其不同作用時間對細菌的抑菌效果，如圖5 所示。結果發現，CPPA 凝膠與細菌共培養2、5、10 和20 min 后，對大腸桿菌的抑菌率分別是36%、63%、57%和＞99%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率分別是39%、60%、85%和＞99%，對變形鏈球菌作用的抑菌率分別是62%、＞99%、＞99%和＞99%，對牙齦卟啉單胞菌的抑菌率分別是34%、58%、88%和98%，與伴放線放線桿菌的抑菌率分別是35%、52%、89%和＞99%。證明僅僅含0.1%w/w CPPA凝膠對條件致病菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)和口腔致病菌(變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線放線桿菌)有著優異的抑菌能力，僅僅含0.1%w/w CPPA 凝膠共培養時間20 min 就可以殺死98%的主要口腔致病細菌。

2.3 生物安全性評價

2.3.1 細胞毒性試驗 MTT 比色法結果表明，0.1%w/w CPPA 凝膠相對增值率(RGR)為88%，與陰性對照組(B)無顯著性差異(圖6)，說明此凝膠無細胞毒性。

2.3.2 急性經口毒性試驗 參照消毒技術規范(2002 版)2.3.1 急性經口毒性試驗進行試驗。以CPPA 溶液5000、4000、2000、1000 mg/kg 劑量分組進行預實驗給藥，找出其粗略致死劑量范圍，然后再設計正式試驗的劑量分組。結果發現，實驗大鼠經口染毒后，最大劑量組5000 mg/kg 無出現中毒癥狀和死亡情況。觀察期14 d 結束后，進行大體病理解剖，主要臟器亦未見異常。因此實驗結果證明，CPPA 對雌雄大鼠急性經口LD50 均大于5000 mg/kg，屬于無毒類物質[18]。

2.3.3 皮膚變態反應試驗(豚鼠最大劑量試驗)進一步利用豚鼠最大劑量試驗評價0.1%w/w CPPA凝膠的生物安全性。實驗結果發現，在去除敷貼24、48 和72 h 后，2%甲醛陽性對照組致敏和激發期間均出現紅斑和水腫，每只動物皮膚刺激反應積分均為＞1，致敏率為100%，為強致敏物質(表1)，而CPPA 凝膠組與陰性對照組在皮內注射激發期間基本一致，豚鼠狀態良好，動物的活動、采食、飲水、排糞、排尿、體重及外觀等亦未出現異常，在封閉敷貼24 h 后，兩組動物局部激發部位均未發現有紅斑和水腫；激發結束后24、48 和72 h，觀察皮膚反應均未發現有紅斑和水腫，每只動物皮膚刺激反應積分為0，致敏率為0%，無潛在致敏性。

圖5 CPPA 凝膠對口腔致病菌的抑菌率

圖6 0.1%w/w CPPA 凝膠的細胞毒性

表1 CPPA 凝膠致豚鼠皮膚變態反應皮膚反應強度評分結果

2.3.4 口腔黏膜刺激試驗 肉眼觀察，去除實驗材料，1 h、2 h、3 h 和4 h 給藥前及末次給藥24 h 肉眼觀察口腔頰囊均未見紅斑、充血、出血、腫脹、糜爛、潰瘍等反應(表2)。與陰性對照組無明顯差異。從組織學觀察評價(表3 和圖7)來說，給藥后的地鼠口腔黏膜上皮完整，顯示上皮連續，細胞層次清楚，未見上皮異常反應；未見炎性細胞浸潤，無出血、水腫、異物反應等其它異常反應。與陰性對照組相比，無明顯異常，可以認為CPPA凝膠對地鼠口腔粘膜刺激的組織學反應為無刺激反應[19]。

表2 急性接觸口腔黏膜刺激試驗肉眼觀察評分結果

表3 急性接觸口腔黏膜刺激試驗組織學評分結果

圖7 急性口腔黏膜刺激試驗的組織切片

3.討論

鑒于使用抗生素會引起細菌耐藥性和生物安全性問題[20,21]，當前市面上沒有替代藥物或醫療器械可用，本研究制備陽離子型聚氨基酸(CPPA)材料，研究其對口腔致病菌抑制作用及其生物安全性，為其在口腔感染防御及治療中的潛在應用價值提供依據。

本研究通過陰離子聚合反應成功制備陽離子型聚氨基酸材料，原料采用人體自身的氨基酸合成，質量安全可控、低價格和高產量使得其實現產業化成為可能。合成的聚氨基酸材料表面含有豐富的陽離子基團，與細菌細胞膜上負電荷之間通過物理靜電作用而結合并聚集在質膜上，擾亂了質膜上的脂質和蛋白質原有的排列秩序，從而導致細胞膜的結構紊亂，從而達到抑菌的目的[22]。0.1%w/w CPPA 凝膠對口腔常見致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線放線桿菌)進行抑菌性能測試結果說明，CPPA 凝膠可在短時間內(20 min)對口腔常見致病菌有較強的抑制作用(抑菌率＞98%)。由此可推測，將來臨床應用中將CPPA 用于口腔內局部用藥，通過短時間的藥物接觸后能抑制口腔致病菌的生長。在安全性評價方面，0.1%w/w CPPA 凝膠無細胞毒性，急性經口毒性劑量LD50≥5000 mg/kg，屬無毒級；最大劑量致敏試驗中，豚鼠移去敷貼24、48 和72 h 后，無紅斑、水腫，致敏率為0，CPPA凝膠無潛在致敏性；在急性口腔黏膜試驗中，無紅斑，組織無病變，CPPA 凝膠對地鼠口腔黏膜無刺激性。經動物實驗結果可以初步判定CPPA 具體良好的生物安全性。

綜合以上，研究結果為進一步評價陽離子型聚氨基酸在口腔感染防治應用，以及其在口腔修復過程中義齒性口炎的預防及治療和口腔牙菌斑(齲病和牙周炎)防治中的潛在應用價值，為探討相應的臨床上有效的預防、治療手段和藥物奠定了前期的試驗基礎。