菜心游離小孢子培養高頻胚誘導培養基優化

楊 易，陳漢才，沈 卓，周 軒，黎庭耀，杜志煒，楊麗璇，張 艷

（1.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.廣州市花都區農業技術管理中心，廣東 廣州 510800）

【研究意義】菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenet Lee）是蕓薹科蕓薹屬中以菜薹為產品的一種蔬菜，是華南地區栽培規模最大的特產蔬菜之一，在華南地區的蔬菜周年供應及出口創匯中起著舉足輕重的作用［1］。菜心具有明顯的雜種優勢，目前通過連續自交選育自交系及雜種親本的傳統育種方法存在自交系純合速度慢、整齊度差、育種周期長等諸多缺陷，且親本長時間單株選擇會造成近交衰退［2］。小孢子培養技術利用未成熟的雄性配子體在離體培養中受到脅迫處理后，其發育命運由花粉向胚胎發育轉變，誘導小孢子胚胎發生并發育為成熟植株，加倍后形成純合的雙單倍體（Double haploid，DH），1～2年內即可獲得大量基因型豐富且遺傳穩定材料，在提高選擇效率和準確度的前提下，可快速選育純系、縮短育種周期，已在作物遺傳育種中廣泛應用［3］?！厩叭搜芯窟M展】自Lichter于1982年首次從油菜小孢子培養中獲得小孢子植株后，Sato報道了通過機械擠壓分離白菜小孢子，熱激培養獲得胚狀體體系，此后白菜類的小孢子培養研究進展迅速，并在生產上得到推廣應用［4-9］。朱允華等［10］對影響菜心游離小孢子培養誘導胚狀體的主要因素研究表明，基因型對小孢子培養出胚率起決定性作用，花序低溫預處理、高溫起始培養和培養基成分均影響菜心游離小孢子胚狀體的誘導。曾小玲等［11］以11個不同基因型的菜心栽培品種為試材，研究不同培養條件對菜心游離小孢子胚誘導和植株再生的影響，結果有7個基因型材料獲得小孢子胚，不同基因型誘導成胚的頻率存在顯著差異，表明基因型是影響菜心小孢子胚發生的主要因素；小孢子第1天熱激培養用170 g/L高濃度蔗糖培養基培養后轉換成含130 g/L蔗糖培養基能顯著提高小孢子胚誘導率；激素配比6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.2 mg/L能促進菜心小孢子誘導成胚。牛劉靜等［12-13］以增城菜心和連州菜心為試材進行小孢子培養，研究了不同基因型、細胞器抗氧化劑處理（VcNa）和植物生長調節劑（BR和TDZ）對小孢子胚胎發生及胚狀體再生成苗的影響，結果顯示培養基中適當濃度的植物生長調節劑可顯著提高小孢子胚的誘導率。與甘藍型油菜小孢子培養模式相似，菜心的小孢子培養同樣受基因型、供體材料生理狀態、培養基成分、熱激處理條件等因素影響?！颈狙芯壳腥朦c】盡管作物育種中誘導單倍體已被廣泛應用，但其主要瓶頸是單倍體胚胎誘導缺乏或效率低下，形成單倍體胚胎的能力高度依賴于物種和基因型。不同物種的小孢子胚胎發生有其自身規律，且受供試植株生長環境、培養基成分及脅迫處理等多方面因素影響，在為特定作物或基因型建立有效培養系統前，需要克服一個或多個瓶頸。目前，在廣東高溫高濕的自然氣候條件下，露天種植環境下的菜心材料處于特定的生理狀態，菜心小孢子誘導率極低，培養方案需要根據具體情況開發或微調?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過調整菜心小孢子培養誘導培養基配方，針對廣東高溫高濕的氣候環境，對秋冬季露天大田種植的不同基因型菜心材料進行小孢子培養，篩選具有穩定性、廣適性、出胚效率高的培養基配方，以期為實現菜心育種親本的高效率選擇和快速純化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣東省農業科學院蔬菜研究所葉菜豆類研究室提供的10份菜心為試材，材料名稱及類型見表1。2019年11月中旬在廣州市白云區試驗基地大棚內，穴盤播種育苗，三葉一心后移栽到大田，田間常規栽培管理；2019年12月中下旬至1月中旬花期取樣進行小孢子培養。

表1 供試材料基本情況Table 1 Basic information of test materials

1.2 試驗方法

1.2.1 菜心小孢子培養方法 參照Takahashi等［14］方法對菜心游離小孢子培養方法進行改進。于晴天上午，取處于初花和盛花期生長健壯的菜心植株的主花序帶回實驗室，4℃低溫處理24 h。挑取小孢子發育處于單核靠邊期的花蕾，用84消毒液滅菌15 min后用無菌水沖洗3次，置于50 mL無菌離心管中，加入少量蔗糖濃度130 g/L的B5培養液，用玻璃棒研碎花蕾，經直徑74.2 μm雙層尼龍網過濾，1 100 r/min離心5 min，沉淀小孢子，棄上清液，加入B5重懸，再離心，棄上清，用NLN培養液懸浮小孢子，分裝在直徑90 mm無菌培養皿中（10個花蕾/皿，NLN培養液 22 mL），Parafilm膜封口，每個處理10皿，3次重復。32℃黑暗培養48 h后，25℃黑暗培養10～15 d，待肉眼可見胚形成。培養皿轉移到25℃搖床50 r/min黑暗培養至成熟子葉胚（培養約23 d），統計小孢子出胚數，計算出胚率。轉入B5固體培養基培養，置于25℃、光強3 000 lx、光照14 h/d條件下培養。

1.2.2 培養基成分對菜心小孢子出胚率的影響設定100、130和160 g/L蔗糖濃度的NLN培養液和營養元素減半、100 g/L蔗糖濃度NLN培養液，簡稱為 NLN-10、NLN-13、NLN-16和1/2 NLN-10。分別觀察記錄不同培養液下小孢子的發育狀態及出胚情況。

1.2.3 6-BA和NAA對菜心小孢子胚誘導的影響 以NLN-10為培養基，選取6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）和NAA（萘乙酸）為培養基添加激素，6-BA濃度分別為0、0.1、0.2 mg/L，NAA濃度分別為0、0.01、0.1、0.15、0.2 mg/L，設計試驗組合，共6個處理，分離試驗材料雜交2號菜心、雜交3號菜心、連州尖葉菜心和Rt19006的小孢子，加入不同激素配比的培養基中，每個處理30皿，32℃熱激48 h后25℃暗培養，23 d后統計子葉胚數量。

試驗數據采用Excel 2013 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型在不同培養基中菜心小孢子胚胎誘導率的差異比較

從表2可以看出，不同基因型的菜心胚狀體誘導率存在較大差異。在用于游離小孢子培養的10份不同基因型菜心材料中，有7份材料成功產生胚狀體，為增城遲菜心2號、雜交3號菜心、60天柳葉尖葉菜心、大青、Rt19006、17057、廣海甜菜薹。7份材料的胚狀體誘導率相差較大，NLN-10處理最易出胚的 Rt19006菜心胚狀體誘導率可達30.36胚/皿，出胚率最低的大青僅為3.45胚/皿，相差近10倍。而增城遲菜心1號、雜交2號菜心、連州尖葉菜心均未產生胚狀體?？梢姡蛐蛯ε郀铙w誘導率有決定性作用。

2.2 不同蔗糖濃度對菜心胚狀體發生的影響

蔗糖在小孢子離體培養中提供營養和維持細胞滲透壓。由表2可知，除增城遲菜心1號、雜交2號菜心、連州尖葉菜心3個材料沒有出胚外，100 g/L蔗糖濃度的NLN（NLN-10）誘導率最高、達30.46胚/皿，且這一規律在7個出胚材料中表現一致；在 1/2 NLN-10處理中，出胚率約為使用誘導培養基NLN-10處理的2/3，但胚狀體的生長速度明顯快于NLN-10組；蔗糖濃度為130 g/LNLN（NLN-13）處理出胚率顯著降低，最高僅為14胚/皿，且該規律在7份出胚材料中表現一致；蔗糖濃度為160 g/L的NLN（NLN-16）處理未出現胚狀體。由此表明，蔗糖濃度為100 g/L和130 g/L（NLN-13）的NLN能夠誘導出胚狀體，但100 g/L NLN（NLN-10）蔗糖濃度最適于菜心小孢子的胚胎發生。

表2 不同基因型和培養基對菜心小孢子出胚率的影響（個/皿）Table 2 Effects of different genotypes and media on embryo production rates of microspore in Chinese flowering cabbages （embryo/dish）

2.3 不同激素配比對菜心胚狀體發生的影響

由表3可知，6組激素組合中，添加6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L的處理出胚效果最佳，雜交2號菜心和Rt19006出胚率分別達11.28、46.93胚/皿，是不加激素出胚率的1.98、1.54倍，而對不加激素處理中沒有出胚的材料雜交3號菜心、連州尖葉菜心的出胚沒有促進作用；隨著激素濃度升高，出胚率中等的材料雜交2號菜心和出胚率相對高的材料Rt19006胚胎發生能力均有所下降?？梢姡欢舛燃に赜写龠M小孢子胚胎發生的作用，且對出胚相對率低材料的促進作用高于出胚率高的；激素不能促使基因型頑固的材料出胚。

2.4 菜心小孢子離體培養形成再生植株的過程

游離小孢子經釋放離體培養發育成子葉胚（圖1A）平均需要23～26 d。子葉胚接種至分化培養基（B5+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L +瓊脂13 g/L），置于光照培養室培養。成熟的子葉胚接種見光起開始逐漸轉綠，且生長迅速；幼嫩的子葉胚接種后光照條件下一周才開始轉綠，且生長緩慢（圖1B）；而肉眼可見的球形胚接種到分化培養基后，個體變大，但不能轉綠，逐漸白化、褐化至死亡。子葉胚分化出側芽后，側芽接種到生根培養基（MS+ 6-BA 0.02 mg/L+ NAA 0.2 mg/L + 瓊脂12 g/L），7～15 d開始生根（圖1C），發育成一棵完整的再生植株（圖1C）。圖1為菜心游離小孢子培養從誘導出胚狀體到形成再生植株過程。據統計，成熟子葉胚接種至分化培養基后，最終能形成再生植株的比例為92.1%～98.3%，而球形胚最終能發育成再生植株的平均比例為0.34%，絕大部分球形胚從肉眼可見到直徑2～3 mm后停止發育。

表3 不同激素配比對菜心小孢子胚誘導率的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on embryo induction rates of microspore in Chinese flowering cabbages

圖1 小孢子培養中植株再生過程Fig. 1 Plant regeneration during microspore culture

3 討論

本研究將10份菜心進行小孢子離體培養，在相同條件下，70%材料成功誘導出子葉胚，而出胚率敏感型材料是不敏感材料的10倍。胚狀體的誘導能力與基因型密切相關，不同菜心品種小孢子培養產胚率存在明顯差異，這與前人研究結果［15-16］一致。

NLN培養基是蕓薹種作物小孢子培養常用配方，也有使用1/2NLN的報道，研究表明，1/2 NLN比全營養的NLN對白菜小孢子胚的誘導效果更好［17-18］。高濃度蔗糖調節細胞滲透壓和提供能源，100～130 g/L蔗糖濃度的NLN是白菜類蔬菜小孢子培養常用培養基，也有使用150 g/L的報道，但是培養后期需要換到較低濃度的蔗糖培養基［19］。在現有研究報道中，大白菜中多采用130 g/L 的NLN（NLN-13），而在小白菜中，采用100 g/L NLN（NLN-10）或者1/2 NLN的都有報道，部分報道100 g/L的1/2NLN（1/2 NLN-10）的培養效果更佳。本試驗中質量濃度100 g/L的蔗糖培養基NLN-10，相較于NLN-13、NLN-16，顯著提高菜心小孢子產胚的數量。其原因是適當的滲透壓可以使花粉小孢子沖破花粉外殼，并啟動胚胎發育，130 g/L蔗糖相較于100 g/L蔗糖濃度高，也會啟動細胞分裂，但會阻礙細胞進一步發育，在顯微鏡下可以看見后期細胞大部分出現空泡化而凋亡，因此100 g/L蔗糖更適合。而1/2 NLN-10培養基處理小孢子胚誘導率低于NLN-10處理，但胚胎生長速度快，推測由于該培養基中營養元素減半，脅迫胚胎迅速發育，以完成生命周期的競爭，造成生長速度不同。

誘導培養基中添加外源激素在白菜類葉用蔬菜游離小孢子培養中有較多應用，對胚胎發生的影響尚未取得一致的研究結果。Sato等［20］認為NAA和6-BA對大白菜小孢子胚誘導無影響，曾小玲等［11］研究了NAA和6-BA的不同濃度配比對菜心胚誘導的影響，結果表明最適宜誘導菜心小孢子胚胎發生的激素濃度是0.05 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA。唐兵等［19］以20個不同基因型白菜栽培品種為供試材料，研究影響白菜游離小孢子胚誘導的因素，結果表明白菜小孢子胚胎誘導的激素最優組合為6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L。在本研究中，不同激素組合和濃度對不同基因型小孢子出胚數的影響有顯著差異，在NLN-10誘導培養基中添加0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA能極顯著提高小孢子子葉胚的數量；當6-BA、NAA濃度上升至0.2 mg/L時，發育成子葉胚的數量下降，畸形胚數量增加，球形胚數量顯著增加，但絕大多數球形胚發育停滯，隨著培養時間的延長，小孢子胚逐漸褐化。植物胚胎從受精開始，激素就開始合成并在胚胎發育建成中起到重要作用，并且生長素類激素在早期發育中隨著細胞數的增加導致濃度開始上升［21］，說明激素在胚胎形成中不可或缺；在本研究中，添加適量外源激素的處理小孢子出胚率顯著上升，說明離體培養的菜心小孢子胚在早期發育過程中自身激素合成缺乏，未能支持胚胎細胞持續發育，而添加外源激素處理與不加激素組對照相比，前者獲得更多數量的胚，說明在菜心小孢子培養中添加適量激素對胚胎發育具有促進作用。而激素濃度提高到一定程度后，反而會對細胞造成毒害，使胚胎發育停滯。

4 結論

通過采用不同蔗糖濃度和激素配比的誘導培養基對不同基因型菜心進行小孢子離體培養的胚胎誘導率綜合分析發現，遺傳背景對小孢子的胚胎發生能力起決定性作用，7份材料獲得胚狀體，各材料間出胚率存在顯著差異，其中Rt19006胚產率最高；而改良培養基成分可以提高胚胎發生率，不同蔗糖濃度的NLN誘導率差異顯著，NLN-10誘導效果最佳，出胚率最高達30.46胚/皿。隨著蔗糖濃度的升高，出胚率顯著下降，NLN-13處理出胚率最高僅為14.27胚/皿，NLN-16處理出胚受到抑制，未出現胚狀體；在NLN-10中分別添加6-BA 0.1 mg/L和NAA 0.1 mg/L，能顯著提高出胚率，最高達46.93胚/皿，是不加激素NLN-10處理出胚率的1.5倍。但該激素組合對難出胚的試驗材料無促進出胚作用；當6-BA和NAA濃度均達到0.2 mg/L時，胚胎生長發育受到抑制。