納米抗體技術及其在食品安全檢測中的應用

翟艷芳，岳 鋒 ，王選年

（1.新鄉學院生物技術研究中心/生命科學技術學院，河南 新鄉 453000；2.鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450001）

食品安全是被定義為食物中有毒或有害物質引起影響人體健康的公共衛生問題［1］。我國是飼料生產和消費大國、動物源食品（肉類、雞蛋、牛奶、水產品）生產大國，是獸用化學制劑、農藥使用量最大的國家之一。每年至少超過5萬t抗菌藥物用于養殖業，超過50%為藥物飼料添加劑，霉菌毒素污染農產品普遍存在，生態環境中重金屬污染嚴重，從農場到餐桌食品安全的風險無處不在。發展靈敏、快速、準確的檢測技術是保障食品安全的最后一道防線。用于篩選成本較低、速度較快的生物分析，尤其是基于抗原-抗體特異性識別的免疫分析，是目前化學性危害因子快速檢測的主流技術。基因工程抗體是按人類設計所重新組裝的新型抗體分子，可保留或增加天然抗體的特異性和主要生物學活性，去除或減少無關結構（如Fc片段），從而克服單克隆抗體在應用范圍方面的缺陷，具有廣闊的應用前景［2］。研究表明，在駱駝科動物中發現的抗體能有效穿透腫瘤組織并快速消除。駱駝科動物自然產生僅由重鏈組成的抗體，其中靶抗原識別部分由單個可變結構域組成，重鏈抗體可變區也被稱為納米抗體，屬于基因工程抗體，具有高溶解度、高穩定性、高特異性、親和力。納米抗體由于其優越的性能，在各種領域有著廣闊的應用前景，包括食品安全檢測、體內和體外疾病診斷、靶向治療、靶向給藥等［3-4］。本文就納米抗體生物學特征、納米抗體展示技術以及在食品安全檢測中的應用進行闡述。

1 納米抗體生物學特征

1.1 納米抗體結構特征

完整常規抗體形似字母Y，基礎單元結構由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈通過二硫鍵連接組成，具有12個蛋白域和完整的Fc段，組成駱駝科重鏈抗體的兩條完全相同的重鏈由鉸鏈區形成的鏈間二硫鍵連接，每條重鏈分子由一個鉸鏈區和兩個恒定區（CH2、CH3）及重鏈可變區（VHH）組成，具有6個蛋白域以及完整Fc片段。駱駝科重鏈抗體與之相比，缺乏輕鏈與恒定區CH1，CH1是與輕鏈經鏈間二硫鍵相連的部位。單域抗體可變結構域（VHH）僅具有1個蛋白域，無Fc片段，分子量小，僅為常規抗體的1/10，約為15 ku，具有增加其溶解度的結構特征［5-8］。

人抗體重鏈的VH與駱駝重鏈抗體的VHH結構存在約75%的同源性，兩者含有雖小但十分重要的差異，差異主要在于FR2和互補決定區（CDR）中。在VH的FR2內，4個高度保守的疏水性氨基酸（V37、G44、L45、W47）與VL結構域相互作用，在VHH中被4種親水性氨基酸（F37、E44、R45、G47）取代，這些氨基酸的取代也解釋了納米抗體的溶解度增加現象。在VHH中，抗原僅被3個環識別而不是6個環，然而VHH中的環與常規mAb相比，缺少3個CDRs區，且環更長。目前已有研究提出通過CDR的延伸擴大VHH互補決定區，尤其是CDR3。VHH中較長的CDR3允許其形成指狀結構，呈暴露的凸環，能夠延伸到靶蛋白上的空腔中，使VHH能夠識別結合獨特的抗原表位，而凸環中的半胱氨酸可與CDR1或FR2的45位點的半胱氨酸形成環間二硫鍵，使得抗體結構更加穩定。VHH較長的CDR將加大抗原結合位點的實際表面，補償VL結構域提供的抗原結合表面區域的缺失，可以解釋VHH在單域形式中的抗原結合能力［9-10］。

1.2 納米抗體獨特優勢

納米抗體相比常規抗體來說有許多獨特優勢，包括：（1）結構簡單，缺乏輕鏈，僅由單個重鏈可變區組成；分子量小，是常規抗體的1/10，約為15 ku［11］，穿透性好；性質穩定，在非常嚴苛的條件（強酸、強堿、高溫等）下仍能保持其生物活性，且適于進行基因工程抗體改造進化，具有優異的穩定性；（2）特異性強，親和力高，FR2結構中存在氨基酸取代，使納米抗體比常規抗體片段更易溶，CDR3使Nbs能識別常規抗體不能識別的抗原位點或是不易接近的抗原位點，如酶活性位點和隱性病毒表位；（3）制備過程簡便，可以在大腸桿菌及酵母菌等生物中高效表達，處于高溫和酸堿溶劑中更穩定，明顯縮短研發周期、降低生產成本，有效解決抗體規模化制備的難題；（4）組織滲透能力強，能夠更快地被正常組織清除，可與半衰期較短的放射性核素結合在體內成像，應用于分子顯像及靶向治療［12-13］。

2 納米抗體庫的分類

納米抗體庫根據構建方式不同分為天然納米抗體庫、免疫納米抗體庫、半合成/合成納米抗體庫。

2.1 天然納米抗體庫

天然納米抗體文庫通常通過對非免疫羊駝外周血淋巴細胞進行mRNA提取，克隆可變區基因庫并通過噬菌體展示及其他技術獲得納米抗體。從該類型的納米文庫中分離抗體的質量取決于庫容大小及多樣性，天然抗體庫的多樣性取決于最初收集不同個體的淋巴細胞數量，還可以通過混合從不同個體動物收集的血樣以確保文庫的多樣性，從而增加最終文庫大小。天然納米抗體文庫無抗原偏好性，可以為任何潛在的抗原鑒定更廣泛的結合物，例如可用于毒性抗原、免疫原性較弱抗原以及自身物質的篩選，但由于未經免疫刺激體細胞成熟的過程，所以只有從庫容大、多樣高的文庫中篩選時才能篩選出高特異性和親和力的抗體［14］。

2.2 免疫納米抗體庫

免疫納米抗體文庫的構建通過免疫羊駝建立免疫抗體庫，構建過程與天然庫相同。免疫抗體庫的制備首先需對動物進行免疫，通過免疫抗原，體內刺激特異性HCAbs在體內進行親和力成熟。通過克隆外周血淋巴細胞中的可變區基因庫，構建庫容約107CFU/mL的抗體庫，并通過噬菌體展示或其他技術進行篩選，所抽取的血液樣品代表免疫動物血流中存在的淋巴細胞的免疫抗體文庫。該方法在很大程度上受到抗原天然抗原性的限制，當抗原具有高致病性（傳染病劑）和毒性或為非免疫原性小分子時，通過免疫動物獲取抗體是不可行的。此外，在駱駝科動物身上進行實驗必須確保沒有染病和動物死亡的風險，也沒有個體間免疫的自然差異，所以該方法在實施過程中的實際效果受動物個體差異性、血流穩定性、靶標抗原性以及毒性等影響［15］。

2.3 半合成/合成納米文庫

庫容大小和多樣性是影響免疫文庫甚至天然文庫的抗體篩選效率的關鍵問題。體內抗體親和力成熟在較大程度上依賴于體細胞超突變［16］，半合成/合成文庫正是模擬這個過程。通過確定抗原特異性的高變序列的CDR，以及保守的框架區（FR），保存納米抗體的結構完整性。隨機化CDR的氨基酸長度和堿基序列，特別是CDR3區，該區域為抗原-抗體的主要結合位點［17］。Yan等［18］基于CABCII10保守的美洲駝單結構域抗體片段（VHH）框架［19］，通過隨機化CDR3區引入多樣性，構建合成噬菌體展示納米體文庫，成功地篩選出針對PA或NGAL的納米抗體。Chen等［20］基于單一框架，通過使用精確設計的簡并堿基，將多樣性限制在4個互補決定區，設計和生成噬菌體展示的合成抗體文庫。Moutel等［21］基于穩健的納米抗體支架hs2dAb，創建了具有高度多樣性的非免疫重組納米抗體庫，成功篩選及鑒定出針對高度多樣化靶標的高功能性結合物。

3 納米抗體技術

納米抗體技術主要包括噬菌體展示技術、核糖體展示技術以及在此基礎上的納米抗體改造技術等。

3.1 噬菌體展示技術

噬菌體展示技術（phage display technology）于1985年首次被George P. Smith提出。該技術基于外源肽或蛋白質與噬菌體表面上的外源蛋白融合表達，依賴于待選蛋白質與其基因之間的物理聯系。目的基因與絲狀噬菌體M13的p3基因的5’末端融合，導致顆粒在其尖端表達［22］。利用抗原抗體特異性結合的特點對噬菌體庫中大量抗體基因進行篩選，與雜交瘤技術相比，噬菌體展示技術可以快速篩選出針對生物體內任何靶蛋白的抗體，且繞開了雜交瘤免疫動物等過程。通過將整個文庫與靶抗原一起孵育，可以對多種抗原包括純化的抗原、裂解物、完整細胞或組織切片等進行篩選，但純化靶抗原仍是最簡單、最有效的方法。洗脫的噬菌體可用于感染大腸桿菌、富集噬菌體，并用之后的輪次篩選［23-24］。ELISA篩選單個克隆以產生抗原特異性抗體，對ELISE陽性克隆進行測序以推析出抗體的氨基酸［25］。

3.2 核糖體展示技術

核糖體展示技術（Ribosome Display Technology，RDT）已被證明是一種強大的體外選擇和體外分子定向進化方法。核糖體展示最初是由Mat等提出［26］，用于從具有高度多樣性的天然文庫中選擇和進化蛋白質或肽，以結合任何選擇的目標靶標用于從折疊蛋白質文庫中產生高親和力結合物。完整的核糖體展示步驟：制備大型DNA文庫，體外轉錄翻譯，親和篩選，體外分子定向進化［27］。首先通過RT-PCR構建scFv基因，使其作為抗體蛋白體外表達模板，然后在體外進行轉錄和翻譯表達，形成核糖體－mRNA－scFv復合物，隨后以固相化的抗原分子親和篩選出高親和力scFv，不需要克隆和轉化文庫。因此通過基于PCR的方法在文庫中引入隨機突變并選擇改進的結合物是非常方便的，可以方便地進行真正的定向進化［28］。核糖體展示的抗體庫大小上限可達1015拷貝。通過核糖體展示技術，可分離抗小分子半抗原抗體。因此，這項技術可有效獲得所需抗體，且不需要動物免疫；能夠檢測農業和食品工業中的小型半抗原，如殺蟲劑、環境污染物或有毒物質。Guerfal等［29］將針對綠色熒光蛋白的駱駝科納米抗體的免疫文庫融合到釀酒酵母凝集素基因（SAGI）的C未端部分，核糖體展示已成功應用于抗體單鏈Fv片段（ScFv），不僅可以選擇特異性而且可以選擇穩定性和催化活性。Roth等［30］描述了從免疫的羊駝中構建VHH抗體酵母表面展示文庫，以及在基于熒光激活細胞分選（FACS）的篩選過程中完成抗原特異性分子的簡便分離。

3.3 抗體改造技術

體外展示方法篩選抗體受限于文庫的庫容及多樣性，從抗體庫中篩選得到的抗體通常親和力較低，此外通過免疫方法獲取特異性抗體，或者是展示方法鑒定過的抗體在免疫過程中，免疫原皮下注射的高濃度抗體具有潛在的可變性或難以預測的溶解度和粘度，抗體異常聚集而引發的抗體皮下傳送被阻止［31］。體外進行抗體親和力成熟的方法有錯配PCR法（error-prone PCR）、DNA改組法（DNA shuffling）和鏈置換法（chain shuffling）、分子模擬和計算機輔助抗體進化。其中后者是當前計算機科學與生物學相結合研究的重要體現。通過物理、化學和分子生物學以及計算機輔助設計的手段進行抗體修飾，對現有抗體進行結構改造來改進其特性［32］。這些特性包括結合親和力和特異性、折疊穩定性、溶解度、藥代動力學、效應子功能，以及與雙特異性抗體和抗體-藥物偶聯物的附著相容性。Kurella等［33］使用同源模型引導的抗體人源化，用分子動力學對抗體進行動態模擬，分析預測抗體的三維結構以及動力學特征，計算抗原抗體在結合過程中的能量變化，能量最小化應用于該人源化模型。通過對關鍵位點的氨基酸的調整，重新引入關鍵構象殘基。該方法不僅消除了空間沖突，還可以恢復與其抗原的結合親和力相關的功能，從而降低其免疫原性、交叉反應率，甚至提高親和力與特異性等，可篩選出更加合理的抗體構象，增強抗體屬性。改造后的抗體特性更適合在臨床和食品安全檢測中應用。

4 納米抗體在食品安全檢測中的應用

納米抗體技術最初應用于診斷和治療領域。目前，大多納米抗體生物技術應用是指蛋白質或其他大分子抗原，而少見報道涉及針對小半抗原（分子量≥1 500 u）使用的納米抗體。但越來越多研究表明，可以從高親和力納米抗體庫中篩選出高敏感性納米抗體。由于納米抗體識別抗原能力較強，可將其作為檢測探針用于檢測各種基體的小分子。通過從噬菌體展示抗體庫中篩選得到針對有害物質的抗體，用于食品真菌毒素、小分子有毒物質或農藥殘留等有機小分子化合物的免疫學檢測中。

4.1 納米抗體檢測食品里的細菌及真菌毒素

毒素有的在食品中天然存在，有的在適合條件或在加工過程產生，其快速檢測方法是保障食品安全的重要措施。Wang等［34］通過噬菌體展示從免疫的羊駝納米抗體庫中分離出了一種對黃曲霉高度反應性的納米抗體PO8-VHH，并開發了一種基于納米抗體和多克隆抗體的夾心ELISA，作為早期檢測系統，適合快速檢測曲霉農產品污染。駱駝科重鏈抗體的可變域也越來越多地適用于檢測各種基質中的小分子。Xu等［35］通過生物淘選從天然羊駝噬菌體展示抗體文庫中獲得高活性微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，MC-LR）噬菌體納米抗體。King等［36］為表明VHH可作為預防李斯特菌病的新型療法的潛力，從天然噬菌體展示文庫中鑒定出幾個結合InlB的LRR結構域的VHH，VHH在InlB的c-Met相互作用位點結合，從而成為防止細菌入侵的競爭性抑制劑，表明VHH有作為預防李斯特菌病的新型療法的潛力。He等［37］首次報道了針對腸炎沙門氏菌的納米抗體，開發的納米抗體具有高的熱穩定性和良好的特異性，并建立一種基于納米抗體的腸炎鏈球菌檢測方法，進一步證明了基于納米抗體的試劑在生物分析化學中的實用性。

4.2 檢測食品中農藥殘留及農產品污染

隨著人們對食品安全性關注的不斷提高，對食品中農藥殘留及農產品污染的檢測研究也越來越多，食品中農藥殘留及農產品污染問題主要是糧食、蔬菜、水果中的農藥殘留超標問題。目前，常見農藥主要分為有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類四大類。殺蟲劑西維因在農業中被廣泛使用，但其殘留物對食品安全和人類健康構成威脅。Liu等［38］使用基于VHH的ELISA法測定食品中大麥和玉米中的西維因，能有效改善農藥殘留檢測的靈敏度。苯氧基苯甲酸（3-PBA）是許多擬除蟲菊酯類殺蟲劑的人類尿代謝產物，可以用作生物標志物。Zhang 等［39］檢測蔬菜和水果樣品中的呋喃丹時，通過從雙峰駝免疫文庫中分離出特異性識別呋喃丹的納米抗體；采用間接競爭性ELISA方法，篩選出的納米抗體具有良好的熱穩定性以及對甲醇和乙腈的高耐受性。Huo等［40］建立了一種基于納米抗體-堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AP）融合蛋白的快速靈敏的直接競爭熒光酶免疫分析法（Direct competition-luciferase immunoassay,dc-FEIA），用于檢測3-PBA，對硫磷是一種廣泛使用的具有高毒性和持久性的有機磷農藥。Zhang等［41］基于免疫的羊駝構建了噬菌體VHH文庫，并通過與3-PBA競爭結合篩選納米抗體，構建了VHH-AP融合物與dc-FEIA，通過對大白菜、黃瓜和生菜樣品進行驗證，進一步證明了基于納米抗體在檢測食品中農藥殘留及農產品污染中的可實踐性，表明基于納米抗體的免疫分析方法簡便，快速且具有成本效益，因此是檢測呋喃丹的理想篩選工具。

5 納米抗體其他方面的應用

5.1 在流行性傳染病的應用

病毒感染容易引起流行性傳染病，一旦感染流感病毒、冠狀病毒等呼吸道病毒疾病會嚴重危害人類的健康和生命，Nbs具有作為抗病毒治療劑的優勢［42-43］。Zhao等［44］成功篩選出專門針對MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域。通過在體內對C末端人Fc標簽進行改造Nbs的半衰期顯著延長，Nbs可以有效地交叉中和從人和駱駝中分離出來的多種MERS-CoV株的感染。說明Nbs可以作為成本低、有效且廣譜的抗MERSCoV治療劑。Stalin等［45］指出Nbs不僅可以針對MERS-CoV，而且可以針對其他新興病原體開發新的干預措施。De等［46］開發了一種新型的抗甲型流感病毒方法，該方法可選擇性地將先天免疫細胞募集到病毒部位復制。針對暴露于表面的病毒抗原的VHH可以很容易地配備效應器功能，這些功能可以觸發保護性抗病毒活性，而不是直接中和病毒。

5.2 在分子成像的應用

在腫瘤成像方面，納米抗體與光學成像、PET、超聲成像及SPECT技術結合用于臨床疾病快速檢測診斷，由于納米抗體的分子量小，沒有Fc片段，可以高特異性地結合到靶標，且可在體內快速消除，使納米抗體在成像方面具有很強優勢。

6 展望

納米抗體在食品安全檢測方面還需要進一步深入研究及應用，它雖克服了小分子功能性抗體的缺點，但仍有不足之處，如親和力低、穩定性差等。體外改善納米抗體性能的方法：（1）確保半抗原-蛋白結合物的免疫原性，提高庫容量及多樣性，通過體外篩選，優化的篩選策略，進行抗體親和力成熟，提高抗體的表達量和表達效率［48］。（2）優化幾個關鍵屬性：親和力、特異性、折疊穩定性、溶解度以及與雙特異性納米抗體和納米抗體-藥物偶聯物的彼此間相容性，主要通過設計支架、互補決定區（CDR）、改變特定的氨基酸等。而單一屬性進行抗體改造時，可能會引起別的關鍵屬性發生質的變化，從而使抗體改造效果不佳。所以，在進行抗體設計時需要進行系統的設計方法。隨著納米抗體改造技術不斷完善，納米抗體特有的優勢也必將在食品安全檢測技術上發揮重要作用。