重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)新型隱球菌DNA

劉曄華，穆紅，張堅(jiān)磊，江雁，劉萍，王猛

天津市第一中心醫(yī)院，天津300192

新型隱球菌是一種條件致病菌，存在于土壤、鴿糞等環(huán)境中，主要感染免疫力低下人群，感染后可侵犯患者皮膚、肺部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部感染和腦膜炎[1]。隱球菌感染是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性真菌感染，可發(fā)生在任何年齡組，免疫抑制或免疫缺陷患者易急性起病[2～5]，形成該菌的體內(nèi)播散性感染，致死率很高。因此，新型隱球菌快速診斷和及時(shí)治療對(duì)預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床常用的新型隱球菌檢測(cè)方法為病原體培養(yǎng)法、墨汁染色法和隱球菌莢膜抗原檢測(cè)，培養(yǎng)法是診斷隱球菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于新型隱球菌生長(zhǎng)緩慢，至少需要72 h給出結(jié)果。加之大多數(shù)情況通過(guò)培養(yǎng)并不能獲得陽(yáng)性結(jié)果，因此該方法無(wú)法滿足臨床大量樣本的高效即時(shí)檢測(cè)(POC)，墨汁染色只適合腦脊液標(biāo)本的檢測(cè)，且陽(yáng)性率偏低，新型隱球菌莢膜多糖抗原的靈敏度和特異性均較好，但與類風(fēng)濕因子、多種細(xì)菌病原體存在交叉反應(yīng)[6]，可導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。基于該病原體核酸檢測(cè)的方法尚未應(yīng)用于臨床。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)是一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用T4噬菌體的重組酶介導(dǎo)核酸引物特異識(shí)別相應(yīng)的DNA位點(diǎn)，進(jìn)而啟動(dòng)聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)[7]，反應(yīng)總過(guò)程<1 h。2019年5月～2020年1月，本研究采用實(shí)時(shí)熒光RPA技術(shù)建立新型隱球菌的快速核酸檢測(cè)方法，旨在為急診診治可疑危重患者提供核酸層面的快速檢測(cè)新型隱球菌的方法。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 ①是建立RPA反應(yīng)體系的新型隱球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC32609(購(gòu)自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)。②是RPA反應(yīng)體系的陰性質(zhì)量控制菌株，包括本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控菌株和臨床分離菌株，鑒于新型隱球菌的送檢標(biāo)本主要為腦脊液、胸水、肺泡灌洗液等，我們針對(duì)性地選取了對(duì)應(yīng)標(biāo)本的普通細(xì)菌培養(yǎng)常見(jiàn)的細(xì)菌和真菌共150株作為驗(yàn)證RPA法特異性的臨床菌株，所有臨床菌株都經(jīng)過(guò)VITEK MS鑒定確證。上述陰性質(zhì)控菌株具體包括：金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、光滑念珠菌ATCC2950、白色假絲酵母菌10株、熱帶假絲酵母菌10株、光滑假絲酵母菌10株、近平滑假絲酵母菌5株、克柔假絲酵母菌1株、葡萄牙假絲酵母菌1株、煙曲霉菌7株、黃曲霉菌3株、紋帶棒狀桿菌5株、解葡萄糖醛酸棒狀桿菌2株、假結(jié)核分枝棒狀桿菌1株、表皮葡萄球菌5株、溶血葡萄球菌5株、人葡萄球菌5株、金黃色葡萄球菌10株、、糞腸球菌5株、屎腸球菌5株、星座鏈球菌3株、咽頰炎鏈球菌5株、大腸埃希菌20株、肺炎克雷伯菌10株、陰溝腸桿菌5株、奇異變形桿菌5株、銅綠假單胞菌5株、糞產(chǎn)堿桿菌1株。③是實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)質(zhì)譜鑒定為新型隱球菌的凍存菌株10株，分別來(lái)自血液標(biāo)本、腦脊液和胸水。驗(yàn)證試驗(yàn)用的100份臨床標(biāo)本包括：檢測(cè)新型隱球菌莢膜多糖抗原的腦脊液留存標(biāo)本50份，其中30份莢膜多糖抗原檢測(cè)陰性，20份莢膜多糖抗原陽(yáng)性(同時(shí)腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性鑒定為新型隱球菌)；痰標(biāo)本15份(其中5份新型隱球菌培養(yǎng)陽(yáng)性，3份結(jié)核分枝桿菌PCR擴(kuò)增陽(yáng)性)；胸腹水15份(其中10份標(biāo)本新型隱球菌培養(yǎng)陽(yáng)性)；靜脈血標(biāo)本20份(5份新型隱球菌血培養(yǎng)陽(yáng)性，其余陰性)。

1.2 試劑和儀器 -80 ℃冰箱(青島海爾)、HHW-21600電熱恒溫水箱(天津中環(huán)電爐廠)、核酸提取儀DP1000(上海科華)、超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)ND5000(北京百泰克)、ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)、Alpha 紫外凝膠成像儀(美國(guó)BioRAD)、DYCP-31電泳儀(北京)、VITEK MS質(zhì)譜儀。血平板(法國(guó)梅里埃天津國(guó)藥代理)、磁珠法核酸提取試劑盒(上海科華)、溴化乙錠、DL600bp DNA marker(天根生化科技北京有限公司)、瓊脂糖凝膠(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)、凝膠法和熒光法RPA試劑盒(蘇州先達(dá)科技有限公司)、新型隱球菌oasig實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(英國(guó)南安普敦PrimerDesign生物科技公司)；PCR擴(kuò)增引物和探針由蘇州泓迅生物科技有限公司完成，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化與測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 新型隱球菌菌株、陰性質(zhì)控菌株和臨床標(biāo)本DNA提取按核酸提取試劑盒(磁珠法)操作說(shuō)明書(shū)，配制核酸裂解液，準(zhǔn)備洗滌液,深孔板，洗脫板和磁套；新型隱球菌菌株和陰性質(zhì)控菌株用1 μL接種環(huán)從血平板上刮取3～5個(gè)相應(yīng)的新鮮傳代菌落，轉(zhuǎn)入加有3 mL 生理鹽水的試管(菌液濃度約為McF2.0)研磨混勻；于腦脊液、胸水等無(wú)菌體液標(biāo)本，取1 mL轉(zhuǎn)入1.5 mL無(wú)菌EP管，12 000 rpm離心5 min，棄去上清，沉淀用200 μL生理鹽水重懸；痰、肺泡灌洗液等呼吸道標(biāo)本按1∶2比例加入4%NaOH消化20 min，12 000 rpm離心5 min，棄上清，加入500 μL生理鹽水振蕩混勻，12 000 rpm離心5 min，棄上清，生理鹽水重復(fù)洗滌2次，加入200 μL生理鹽水重懸；靜脈血標(biāo)本12 000 rpm離心5min，血漿備用。在深孔板中依次加入20 μL去抑制劑、200 μL標(biāo)本提取菌懸液或血漿和400 μL裂解液，放入磁套；將深孔板和磁套轉(zhuǎn)入核酸提取儀DP1000中，運(yùn)行核酸提取程序(包括裂解-清洗-洗脫步驟)；提取程序結(jié)束后，小心取出含有磁套的洗脫板，在磁力架上放置1 min，取下磁套，每孔取1 μL用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)ND5000測(cè)算上清液OD260/OD280、OD260/OD230， OD260/OD280>1.8且OD260/OD230>2.0說(shuō)明提取DNA純度較高。提取的DNA溶液分裝至EP管(每孔15 μL DNA溶液，分裝于3個(gè)EP管)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｗ罱KATCC32609經(jīng)過(guò)VITEK-MS鑒定復(fù)核為新型隱球菌菌株標(biāo)準(zhǔn)株。各待測(cè)菌株、臨床樣本DNA提取結(jié)束后，可見(jiàn)洗脫板各孔位磁珠聚集良好，無(wú)磁珠成團(tuán)片狀現(xiàn)象，用加樣槍易吹打混勻。OD260/OD280>1.8且OD260/OD230>2.0， 說(shuō)明提取陰性質(zhì)控菌株、臨床標(biāo)本DNA均符合試驗(yàn)要求。

1.4 新型隱球菌DNA引物擴(kuò)增及鑒定 凝膠法RPA擴(kuò)增新型隱球菌DNA引物。引物設(shè)計(jì)原則參考Twist Dx公司說(shuō)明(http://www.twistdx.co.uk/)，在新型隱球菌5.8SrRNA編碼基因區(qū)域共設(shè)計(jì)6對(duì)引物，見(jiàn)表1用凝膠法RPA基礎(chǔ)試劑盒篩選可穩(wěn)定擴(kuò)增出新型隱球菌DNA片段引物50 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：溶解劑20 μL，10 μmol/L 的引物F、引物R各1.5 μL，ATCC32609的DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至48 μL，混勻后即刻加入激活劑2 μL，瞬時(shí)離心后放置在37 ℃水浴鍋中，反應(yīng)20 min。擴(kuò)增后，取各引物1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察反應(yīng)結(jié)果，陽(yáng)性視為可穩(wěn)定擴(kuò)增出新型隱球菌DNA引物。另取ATCC32609菌株懸液以1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀釋，半定量法檢測(cè)凝膠電泳陽(yáng)性引物和試劑對(duì)ATCC32609標(biāo)準(zhǔn)株的靈敏度，。以凝膠電泳反應(yīng)陽(yáng)性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果為目標(biāo)片段，通過(guò)PUBMED網(wǎng)站進(jìn)行blast比對(duì)，分析凝膠電泳陽(yáng)性引物是否為新型隱球菌編碼核糖體RNA的DNA片段。凝膠電泳陽(yáng)性引物擴(kuò)增150株陰性質(zhì)控菌株，觀察是否存在擴(kuò)增條帶，驗(yàn)證該反應(yīng)的特異性。

表1 引物擴(kuò)增反應(yīng)陽(yáng)性的新型隱球菌DNA引物

1.5 新型隱球菌DNA引物探針的設(shè)計(jì)、鑒定 采用實(shí)時(shí)熒光RPA法。分別用引物2、5、6目的片段設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，最終引物6的擴(kuò)增片段中找到適合的探針，因此，新型隱球菌的的引物為F(5′→3′) CACGTTTTACACAAACTTCTAAATGTAATG，R(5′→3′) CAAGTTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTG，探針為：CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA[FAM-dT]A[THF]G[BHQ-dT]AATGTGAATTGCA[3′-C3spacer]。采用實(shí)時(shí)熒光RPA法，以ATCC32609菌株基因組DNA和150株陰性質(zhì)控菌株DNA為模板,加入設(shè)計(jì)探針檢測(cè)該引物，觀察是否存在擴(kuò)增條帶(存在擴(kuò)增條帶即為擴(kuò)增反應(yīng)陽(yáng)性)，驗(yàn)證該反應(yīng)的特異性。50 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：溶解劑20 μL，10 μmol/L 的引物F和引物R各1.5 μL，探針0.6 μL ，DNA模板2 μL， ddH2O補(bǔ)足至48 μL，混勻后即刻加入激活劑2 μL，瞬時(shí)離心后，在ABI 7500儀器上設(shè)置每個(gè)循環(huán)為37 ℃，1min，每個(gè)反應(yīng)循環(huán)自動(dòng)采集熒光，共20個(gè)循環(huán)。所有檢測(cè)孔位均為復(fù)孔檢測(cè)。取實(shí)驗(yàn)室保存的10株新型隱球菌臨床分離株加入設(shè)計(jì)探針后進(jìn)行擴(kuò)增，ABI7500軟件上觀察擴(kuò)增后熒光成像結(jié)果。

1.6 熒光法RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)新型隱球菌DNA檢測(cè)的一致性比較 取10株新型隱球菌臨床分離株和100份臨床樣本(包括腦脊液50份、 痰15份、胸腹水15份、靜脈血20份)，分別用熒光法RPA和實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行DNA擴(kuò)增。熒光法RPA操作同“1.5”，實(shí)時(shí)熒光PCR法按照英國(guó)oasig 實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的說(shuō)明，擴(kuò)增反應(yīng)體系：主反應(yīng)劑10 μL，引物/探針混合物1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 4 μL，共計(jì)20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、15 min；95 ℃、10 s，60 ℃、1 min，50個(gè)循環(huán)。所有檢測(cè)孔位均為復(fù)孔檢測(cè)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，ABI7500軟件上觀察熒光成像結(jié)果。

2 結(jié)果

引物2、5、6的目的條帶清晰，無(wú)彌散拖尾現(xiàn)象，引物擴(kuò)增反應(yīng)陽(yáng)性；1∶105稀釋的ATCC32609模板DNA凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)新型隱球菌陽(yáng)性條帶。blast比對(duì)結(jié)果為，引物2、5、6均屬于新型隱球菌編碼核糖體RNA的DNA片段，比對(duì)結(jié)果符合率為100%。用引物6擴(kuò)增陰性對(duì)照菌株后，凝膠電泳未見(jiàn)擴(kuò)增條帶。見(jiàn)圖1、2、3。

注：從左到右依次是DL600bp marker,編號(hào)1～6引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中編號(hào)為2、5、6號(hào)引物的目的條帶清晰，無(wú)彌散拖尾現(xiàn)象。第2、5、6組引物的擴(kuò)增目的條帶依次為170、193及170 bp。

注：M表示DL600bp marker,條帶1～6分別是原液、1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀釋的新型隱球菌ATCC32609基因組DNA上樣擴(kuò)增結(jié)果。

注：起始劃線部分是第6對(duì)引物的F98序列

引物6設(shè)計(jì)的探針實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)結(jié)束時(shí)可見(jiàn)S形陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖4；所有陰性對(duì)照菌株擴(kuò)增結(jié)果陰性。對(duì)ATCC32609菌懸液1∶105稀釋后加入引物6設(shè)計(jì)探針仍可見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖5。加入引物6設(shè)計(jì)探針后擴(kuò)增10株新型隱球菌菌株均可見(jiàn)S形陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖6。熒光法RPA試劑、oasig實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)100份臨床樣本中擴(kuò)增反應(yīng)陽(yáng)性的分別為40、40份。

圖4 新型隱球菌ATCC32609和陰性質(zhì)控菌株的熒光法RPA擴(kuò)增曲線

圖5 新型隱球菌ATCC32609菌懸液依次稀釋后的實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增結(jié)果

圖6 熒光法RPA檢測(cè)新型隱球菌臨床分離菌株的擴(kuò)增曲線

3 討論

目前臨床常用的檢測(cè)新型隱球菌的方法包括血液、腦脊液培養(yǎng)，從上機(jī)培養(yǎng)到儀器報(bào)陽(yáng)以及后續(xù)的轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基、鑒定、藥敏，至少需要3～5 d才能完成試驗(yàn)。培養(yǎng)法對(duì)于病原體檢測(cè)是金標(biāo)準(zhǔn)，但時(shí)間周期太長(zhǎng)。傳統(tǒng)檢測(cè)方法比如墨汁染色最適合腦脊液的檢驗(yàn)，但是陽(yáng)性檢出率很低，且胸水、痰液、分泌物等標(biāo)本無(wú)法使用該方法進(jìn)行檢測(cè)；隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)是血清學(xué)方法，適用的標(biāo)本類型包括血清、血漿和腦脊液，檢測(cè)采用金標(biāo)法，10～15 min即可得到結(jié)果，方便快速是它的最大優(yōu)勢(shì)，但是該方法所受的影響因素仍然較多，與類風(fēng)濕因子、多種細(xì)菌病原體存在交叉反應(yīng)[7]，可導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性，該方法多作為檢測(cè)是否存在新型隱球菌感染的一個(gè)充分條件，檢測(cè)結(jié)果無(wú)法作為診斷新型隱球菌感染金標(biāo)準(zhǔn)。

本研究應(yīng)用基于RPA的恒溫PCR擴(kuò)增技術(shù)是從核酸水平檢測(cè)新型隱球菌，目前已有的新型隱球菌實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑屬于傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)范疇，上機(jī)反應(yīng)時(shí)間為95 min，且成本較高；RPA反應(yīng)最大的優(yōu)勢(shì)在于高效和快速，反應(yīng)只需20 min，加上樣本的前處理時(shí)間，總共1 h即可得到檢測(cè)結(jié)果。因?yàn)楸狙芯啃枰獪y(cè)試建立RPA技術(shù)檢測(cè)新型隱球菌的反應(yīng)體系，會(huì)用到大量的菌株標(biāo)本和臨床樣本進(jìn)行靈敏度和特異性的測(cè)試，因此采用核酸提取儀批量提取了各類待檢樣本的DNA，如果該實(shí)驗(yàn)后續(xù)應(yīng)用于臨床，尤其是急診危重患者的樣本檢測(cè)，就需要靈活的提取送檢標(biāo)本的DNA，目前已有商品化的提取各類樣本DNA的手工試劑盒，從獲得樣本并提取DNA上機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)樣本的即時(shí)單個(gè)或多個(gè)快速處理，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)新型隱球菌的面向急診和危重患者的快速核酸檢測(cè)。目前本研究正補(bǔ)充完善不同的DNA提取技術(shù)是否會(huì)對(duì)RPA實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響的相關(guān)試驗(yàn)研究，爭(zhēng)取使熒光法RPA檢測(cè)技術(shù)做到既適合單一急診樣本的快速提取和檢測(cè)，也適合大量樣本的自動(dòng)化檢測(cè)。

RPA法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于方便快速，國(guó)內(nèi)已經(jīng)有通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)人腺病毒[8]、銅綠假單胞菌[9]的報(bào)道，前者使用的是RPA結(jié)合橫向流體試紙條的檢測(cè)法，后者采用的是RPA熒光法，這些技術(shù)的運(yùn)用使得RPA法真正做到了快速簡(jiǎn)便可視；如果該實(shí)驗(yàn)終止于凝膠法，那么它不是能夠應(yīng)用于臨床的檢測(cè)技術(shù)，因?yàn)槟z電泳不僅耗費(fèi)時(shí)間和人力，而且擴(kuò)增產(chǎn)物開(kāi)蓋檢測(cè)極易造成氣溶膠污染，將來(lái)實(shí)驗(yàn)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。所以RPA凝膠法檢測(cè)更多是作為篩選引物來(lái)應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)最終篩選出1對(duì)適合設(shè)計(jì)探針的引物。有了合適的引物和探針，檢測(cè)新型隱球菌的實(shí)驗(yàn)才過(guò)渡到RPA熒光法，達(dá)到對(duì)新型隱球菌快速核酸檢測(cè)的目的。 RPA熒光法從核酸層面檢測(cè)新型隱球菌，首先保證了該檢測(cè)更接近于檢測(cè)病原體本身；其次擴(kuò)大了適用檢測(cè)樣本的范圍，只要能對(duì)取材的樣本進(jìn)行DNA提取,就適用于這種檢測(cè)方法。需注意的是，隱球菌病患者與分枝桿菌感染患者癥狀相似，所以送檢標(biāo)本中極易含有分枝桿菌，本研究也評(píng)估了該方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌PCR擴(kuò)增陽(yáng)性痰標(biāo)本的特異性，結(jié)果顯示無(wú)非特異性擴(kuò)增，而且痰標(biāo)本屬呼吸道開(kāi)放標(biāo)本，在做PCR檢測(cè)時(shí)需要消化洗滌等處理步驟，它的前處理都是手工完成，因此更要嚴(yán)格按照試劑盒推薦的步驟完成操作。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光法RPA技術(shù)檢測(cè)新型隱球菌方便快捷。本研究不足之處在于驗(yàn)證 RPA實(shí)驗(yàn)的臨床標(biāo)本數(shù)量較少，且陽(yáng)性標(biāo)本更少，無(wú)法獲知疑似感染患者取材標(biāo)本的RPA反應(yīng)檢出能力。因此，我們?cè)诮窈蟮尿?yàn)證試驗(yàn)中，將主要關(guān)注臨床送檢的各類標(biāo)本，尤其是急診和神經(jīng)內(nèi)科、ICU等科室懷疑隱球菌感染患者的取材標(biāo)本，使RPA檢測(cè)新型隱球菌的技術(shù)聯(lián)合新型隱球菌莢膜抗原檢測(cè)技術(shù)，真正作為急診和危重患者的快速篩查檢測(cè)手段在臨床推廣應(yīng)用。