益腎降濁沖劑對慢性腎衰大鼠腎組織細胞凋亡及BAX、Bcl-2蛋白表達的影響*

★ 傘勤 鄭敏麟** 劉廣 駱丹嵐 阮詩瑋（.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 福州350；.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院 福州 350004）

益腎降濁沖劑有“健脾益氣，補脾益腎，培土制水”的功效，在福建中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院用于治療慢性腎功能衰竭（chronic renal failure， CRF）已有20余年。其可有效降低CRF患者血清肌酐（serum creatinine， Scr）、尿 素 氮（blood urea nitrogen， BUN）水平，改善臨床癥狀，有效延緩CRF進程，療效確切。吳競等［1]研究證明，西藥配合益腎降濁沖劑治療在延緩腎功能方面較單純西藥治療明顯更有優(yōu)勢，其可有效降低患者血清BUN、Scr，改善患者血清內(nèi)皮素水平，可明顯改善患者臨床癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)，益腎降濁沖劑可以改善CRF患者血清鈣磷代謝及降低成纖維生長因子23水平，進而延緩病情進展［2]。

此前，作者曾采用5/6腎切除大鼠CRF模型，同時用大黃素作為治療對照組，觀測用益腎降濁沖劑治療慢性腎功能衰竭的療效，并初步探討CRF“腎小管高代謝學說”的深層機理和益腎降濁沖劑作用機制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組的腎臟的病理和超微結(jié)構(gòu)損傷最重，線粒體腫脹明顯，且血漿MDA水平顯著增高，SOD水平顯著降低，而經(jīng)益腎降濁沖劑干預，以上改變能明顯減輕［3-4]。

本研究在此前對益腎降濁沖劑治療5/6腎大部切除術(shù)CRF大鼠實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)觀測益腎降濁沖劑治療對5/6腎大部切除術(shù)CRF大鼠的腎臟組織細胞凋亡及對Bcl-2、BAX蛋白表達的影響；基于線粒體介導的細胞凋亡途徑，對益腎降濁沖劑的藥物作用靶點和藥理機制進行了進一步的深入探討。

1 材料及方法

1.1 實驗動物60只健康的清潔級SD雄性大鼠，購至中科院上海動物飼養(yǎng)中心，合格證號：2015000535181，許 可 證 號：SCXK（滬）2012-0002，喂養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物中心。體重180～220g，自由進食進水。飼養(yǎng)于自然光條件，濕度為50%～70%，恒溫。

1.2 試劑益腎降濁沖劑（購自福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院），由生黃芪30g、太子參15g、白術(shù)15g、茯苓15g、玉竹15g、當歸15g、桑椹15g、桑寄生15g、懷牛膝15g、丹參15g、山楂15g、陳皮15g、大黃15g、六月雪15g、車前子15g組成。大黃素（北京索萊寶科技有限公司）；HE染色試劑盒（源葉公司）；Tunel試劑盒（上海羅氏）；Bcl-2、BAX多克隆抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；DAB顯色劑（福州邁新公司）。

1.3 分組與造模60只實驗用大鼠適應性喂養(yǎng)7d后，隨機取48只行腹腔麻醉后。以腹臥位在大鼠左背部手術(shù)區(qū)去毛，并常規(guī)消毒及鋪巾，沿左肋脊角做約2.0cm斜切口，從腹側(cè)往切口托出腎臟充分暴露左腎后，鈍性分離腎周脂肪囊，迅速弧形切除共占左腎皮質(zhì)2/3的上、下兩極皮質(zhì)，立即滴加凝血酶并紗布按壓止血，復位腎臟，縫合組織；1周后切除右腎［5]。另12只以同樣程序進行，但不切腎臟，為假手術(shù)組。切除腎臟的48只大鼠隨機均分為模型組、大黃素治療組及大、小劑量益腎降濁沖劑組。益腎降濁沖劑小劑量組，每日灌服益腎降濁沖劑6g/kg，益腎降濁沖劑大劑量組，每日灌服18g/kg，大黃素治療組，每日灌服大黃素50mg/kg。假手術(shù)組和模型組灌服相同量的蒸餾水。

1.4 指標檢測

1.4.1 血清腎功能指標檢測 離心管收集腹主動脈（非抗凝）血液，離心收集血清以備測BUN、Scr含量。

1.4.2 腎臟組織病理改變檢測 取左腎組織固定于4%多聚甲醛24h后，進行石蠟包埋，切4μm切片進行攤片、撈片，58℃烘片后脫蠟、脫水處理，蘇木素染色15min，伊紅染色30s，透明并樹膠封片，光學顯微鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)變化并拍片。

1.4.3 Tunel染色檢測細胞凋亡 切片后，常規(guī)脫蠟、脫水，PBS洗滌3次，加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵15min。PBS清洗3次，吸出組織上多余液體，滴加0.1% Triton X-100透化液，常溫孵育8min。甩去玻片上的溶液并用PBS洗滌三次。吸出組織上多余液體，將TUNEL反應混合液滴加在組織上，避光孵育60min。PBS清洗后，滴加Converter-POD，保濕孵育30min。PBS洗滌，在顯微鏡觀察下滴加DAB顯色。蘇木素復染，脫水、透明、封片。顯微鏡觀察并隨機選取視野進行拍照。

1.4.4 免疫組化染色檢測BAX、Bcl-2凋亡蛋白 取石蠟包埋的腎組織，4μm切片后，行脫蠟水化，微波熱修復8min。冷卻后PBS洗滌，室溫下山羊血清封閉20 min后，滴加一抗4℃過夜。次日，PBS洗滌后滴H2O2 孵育10 min。再次PBS洗滌后，滴二抗室溫孵育1h，PBS清洗，DAB顯色3～5min，顯微鏡下觀察顯色程度，自來水沖洗，蘇木素染核2min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗15min，酒精脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察并拍片。

1.5 統(tǒng)計方法結(jié)果采用SPSS 22.0 軟件包進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，多組數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清腎功能指標的比較見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清Scr和BUN值明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，益腎降濁沖劑大劑量和大黃素組Scr和BUN值明顯下降（P＜0.05）。且與大黃素組比較，益腎降濁沖劑大劑量組血清Scr和BUN值明顯下降（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腎臟組織病變的比較見圖1。與假手術(shù)組相比，模型組腎小球明顯變性、數(shù)量減少，腎小囊腔和腎小管管腔出現(xiàn)明顯擴張，其特征在于囊腔內(nèi)有輕微染色的蛋白性液體，足細胞空泡變性，部分腎小管出現(xiàn)蛋白管型，壞死處可見大量淋巴和單核細胞浸潤；與模型組相比，益腎降濁沖劑大劑量組和大黃素組的腎臟組織腎小球病變有明顯改善，腎小囊腔和腎小管擴張減輕，蛋白管型明顯減少，淋巴和單核細胞浸潤明顯減少。

表1 各組大鼠血清腎功能對比（，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與大黃素組比較，△P＜0.05。

組別 模型組 假手術(shù)組 大黃素治療組 益腎降濁沖劑大劑量組 益腎降濁沖劑小劑量組BUN 18.63±2.67 7.42±0.92*△ 16.33±1.95* 14.23±1.76*△ 18.47±2.25 Scr 120.96±20.43 41.56±10.80*△ 95.88±10.88* 82.40±8.35 *△ 114.08±19.51

圖1 各組大鼠腎組織HE染色圖片（spx200）

2.3 各組大鼠細胞凋亡的比較見圖2和表2。與假手術(shù)組比較，模型組凋亡數(shù)明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，益腎降濁沖劑大劑量組和大黃組凋亡指數(shù)明顯下降（P＜0.05）；且益腎降濁沖劑大劑量組凋亡數(shù)明顯少于大黃組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腎組織Tunel染色圖片（spx400）

表2 各組大鼠腎細胞凋亡數(shù)比較（，n=12）

表2 各組大鼠腎細胞凋亡數(shù)比較（，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與大黃素組比較，△P＜0.05。

分組 模型組 假手術(shù)組 大黃素組 益腎降濁沖劑大劑量組 益腎降濁沖劑小劑量組凋亡數(shù) 911.40±91.81 191.60±42.69*△ 487.00±77.83* 266.60±59.50*△ 905.60±76.47△

2.4 各組大鼠BAX、Bcl-2在腎臟組織表達的比較見圖3和表3。與假手術(shù)組比較，模型組BAX表達明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，益腎降濁沖劑大劑量組和大黃素組BAX表達明顯下降（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2表達明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，益腎降濁沖劑大劑量組和大黃組Bcl-2表達明顯上升（P＜0.05）。且與大黃素組比較，益腎降濁沖劑大劑量組BAX表達明顯減少，Bcl-2表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腎組織BAX、Bcl-2蛋白表達圖片（spx400）

3 討論

益腎降濁沖劑，是福建省名中醫(yī)阮詩瑋教授的經(jīng)驗方，方以生芪、太子參、白術(shù)、茯苓健脾益氣、培土制水，為君藥；大黃活血排毒泄?jié)幔叭t正安而脾健，為臣藥；山楂、當歸、玉竹、桑椹，佐君藥滋脾腎之陰以助運，益母草、六月雪佐臣藥大黃以活血排毒泄?jié)幔矠樽羲帯Ｒ躁惼槭梗戮幯a而不滯，脾氣周流而水邪得制。全方具有健脾益腎、祛瘀泄?jié)岬墓πВ謴汀捌⒅扑钡墓δ埽パa兼?zhèn)洌龠M體內(nèi)尿毒癥毒素的排出。

表3 各組大鼠腎組織BAX和Bcl-2的表達（，n=12）

表3 各組大鼠腎組織BAX和Bcl-2的表達（，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與大黃素組比較，△P＜0.05。

組別 模型組 假手術(shù)組 大黃素治療組 益腎降濁沖劑大劑量組 益腎降濁沖劑小劑量組BAX 1157.40±123.31 224.80±51.64*△ 796.60±40.64* 505.20±14.04*△ 1027.00±98.39 Bcl-2 157.60±38.66 789.00±73.23*△ 412.80±70.96* 559.60±73.15*△ 194.80±67.01

細胞凋亡是程序性細胞死亡的主要模式，在組織穩(wěn)態(tài)的發(fā)展與維持中起重要作用。它主要有兩種凋亡信號通路：死亡受體介導的外在途徑及線粒體介導的內(nèi)在途徑［6]。Bcl-2家族的蛋白質(zhì)是內(nèi)在途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括促凋亡的BAX蛋白和抑凋亡的Bcl-2蛋白。異源二聚體由Bcl-2和BAX蛋白共同組成，可抑制細胞凋亡；同源二聚體由BAX蛋白組成，促進細胞凋亡［6-8]。因此，Bcl-2和BAX蛋白間的表達關(guān)系決定了細胞的凋亡狀態(tài)，若升高BAX /Bcl-2比值可促進細胞凋亡，而降低BAX / Bcl-2比值則抑制細胞凋亡。

BUN和Scr是傳統(tǒng)臨床病理學中檢測腎功能最常用的指標。本研究顯示，CRF大鼠血清BUN（18.63±2.67）、Scr（120.96±20.43）水平較高，大劑量益腎降濁沖劑灌胃治療模型組大鼠2個月后BUN（14.23±1.76）、Scr（82.40±8.35） 含量有效降低，效果優(yōu)于大黃素組大鼠血清BUN（16.33±1.95）、Scr（95.88±10.88）。且通過病理組織切片觀察，其能夠有效改善腎臟組織病變，提示益腎降濁沖劑對慢性腎衰大鼠腎組織有一定的保護作用。本研究結(jié)果進一步顯示，模型組大鼠腎細胞凋亡數(shù)最高（911.40±91.81），經(jīng)益腎降濁沖劑大劑量和大黃素治療后細胞凋亡數(shù)均明顯降低（266.60±59.50），（487.00±77.83）；且益腎降濁沖劑大劑量組凋亡數(shù)低于大黃素組（P＜0.05），說明益腎降濁沖劑大劑量治療效果優(yōu)于大黃素組。與正常組相比，CRF組腎組織中BAX表達顯著增加（1157.40±123.31）、Bcl-2表達水平顯著降低（157.60±38.66），而用大劑量益腎降濁沖劑和大黃素灌胃2月后CRF大鼠腎組織BAX 蛋白表達明顯下降、Bcl-2蛋白表達明顯增加，提示益腎降濁沖劑可能通過提升腎組織中Bcl-2的蛋白表達，同時下調(diào)腎組織中Bax的蛋白表達，從而使慢性腎衰進展得到減緩。本課題組前期研究表明，益腎降濁沖劑可改善線粒體結(jié)構(gòu)和功能、減少自由基的產(chǎn)生、從而保護慢性腎功能衰竭大鼠腎臟。本研究結(jié)果進一步證明了，益腎降濁沖劑通過抑制氧自由基介導的線粒體凋亡信號通路，調(diào)節(jié)腎組織中BAX和Bcl-2（二者均為凋亡內(nèi)在途徑線粒體凋亡信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）的蛋白表達從而達到減緩腎細胞凋亡，來到達改善腎衰大鼠腎組織病理、延緩腎衰進程的目的。

綜上所述，益腎降濁沖劑可能通過改善線粒體呼吸功能、減少自由基的產(chǎn)生，抑制氧自由基介導的線粒體凋亡信號通路，從而保護慢性腎功能衰竭大鼠腎臟，延緩慢性腎衰的進程。