Th17細胞相關因子在早晚期肺癌患者中的表達差異及臨床意義

錢濤濤 施舜繽 朱 勇 張 林 王海龍

肺癌是當今世界對人類健康危害較大的惡性腫瘤疾病之一，其5年生存率僅為10%～15%，疾病的治療效果與中位生存期均不盡如人意，故研究肺癌的發生發展相關機制對其合理治療與預后有積極意義[1-4]。至今，肺癌的病因及發病機制仍未完全明確，傳統觀點認為疾病的發生、發展可能與家族遺傳、吸煙、空氣污染、電離輻射、職業致癌因子的活化及抑癌基因失活有關[5-6]。然而，隨著研究的深入，越來越多的研究證實，在肺癌等惡性腫瘤發生發展期間，細胞免疫有著至關重要的作用[7-8]。輔助性T細胞17(helper T cell 17, Th17)是最近發現的新效應性CD4+細胞亞群的一種，分泌白細胞介素-17(interleukin-17, IL-17)是其主要臨床特征，此外，Th17細胞還可分泌白細胞介素-21(interleukin-21, IL-21)等細胞因子，并在介導慢性炎癥、防御胞外細菌感染、腫瘤及自身免疫性疾病等過程中發揮關鍵作用[9-10]。研究發現，IL-17能選擇性上調肺癌患者部分血管源性因子，從而加速腫瘤新血管生成，增加腫瘤體內微血管數量與密度，推動腫瘤的生長、轉移及浸潤[11-12]。研究顯示Th17細胞相關因子在惡性腫瘤疾病中表達，但其在肺癌不同分期中的表達鮮有報道。本文觀察Th細胞相關因子在早期與晚期肺癌患者中的表達差異，分析其臨床意義，以期為未來肺癌免疫研究提供參考依據，現報道如下。

資料與方法

一、研究對象

選擇2016年2月至2019年2月收治的41例NSCLC患者作為研究組，其中男16例，女25例；年齡38～77歲，平均年齡(62.4±10.9)歲；體質量47～80 kg，平均(64.1±6.8)kg；受教育程度：14例小學及以下，16例初中或中專，11例高中及以上；組織學類型：腺癌29例，鱗癌12例；臨床分期(參照2009年肺癌國際分期標準判定)[13]：Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。另選同期在我院接受常規體檢的19例健康者作為對照組，其中男10例，女9例；年齡35～75歲，平均年齡(60.3±10.5)歲；體質量45～80 kg，平均(63.9±6.8)kg；受教育程度：8例小學及以下，6例初中或中專，5例高中及以上。入選標準：(1)研究組：經病理學或細胞學，并結合影像學檢查結果證實為NSCLC患者；患者均為初次確診；既往無化療、放療、手術及生物治療史；(2)對照組：全部入組者相互之間無血緣關系，未合并支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等急慢性疾病，既往無類風濕性關節炎、多發性硬化癥、肝炎病史等自身免疫性疾病，未合并其他惡性腫瘤疾病。研究組與對照組性別、年齡體質量、受教育程度等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，有可比性。本項目獲得院醫學倫理委員會批準，全部入組受檢者及其家屬均知情，并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.Th17細胞因子檢測：采集全部入選者空腹外周靜脈血4 ml，并置于肝素鈉抗凝管內，25 ℃室溫下水平放置，8 h內實施流式細胞術檢測前處理，同時使用干燥管采集外周靜脈血3 ml，凝固后離心，取500 μl上清液置于EP管內，在-20 ℃條件下保存待檢。

2.儀器與試劑：上海艾研生物科技有限公司提供的可調式移液器，科大創新股份有限公司提供的臺式低速離心機，美國貝克曼公司提供的EXPO32 ADC流式細胞儀，中科美菱低溫科技有限公司提供的低溫冰箱，美國Satorus公司提供的電子天平，江蘇金壇市醫療儀器廠提供的恒溫水浴箱，上海躍進醫療器械廠提供的孵育箱，廣州普陽醫療科技有限公司提供的肝素鈉抗凝管，美國Corning Costar公司提供的24孔細胞培養板，北京天石天星科技有限公司提供的全自動酶免疫分析儀與全自動洗板機，青島海爾公司提供的4 ℃冰箱。主要試劑包括莫能霉素、佛波酯、PE-抗人IL-17、PBS液，試劑均由美國Sigma公司提供。

3.Th17細胞檢測：500 μl PBMC懸液，在標本內加入250×PMA/Ionomycin 2 μl和250×Monensin/BFA 2 μl，混勻；37 ℃、5% CO2培養箱培養5 h。每管加入100 μl刺激后，測定管加入10 μl CD3-PE-Cy5和10 μl CD8-FITC，4 ℃避光孵育30 min。加入FIX&PERM Reagent A 100 μl，室溫孵育15 min；加入3 ml染色緩沖液，300 g離心5 min，棄上清收集細胞。渦旋，加入100 μl FIX&PERM Reagent B 100 μl，同時加入10 μl IL-17抗體，室溫孵育20 min；加入3 ml染色緩沖液，300 g離心5 min，棄上清收集細胞。對應的對照管中加入同等μg數同型對照。加入5 ml PBS重懸細胞后上流式細胞儀檢測。莫能霉素使淋巴細胞表面CD4抗原內陷，故以CD8-FITC反標，散點圖中上左象限即為Th17細胞占淋巴細胞的比例。

4.Th-17細胞相關因子檢測：使用酶聯免疫吸附法檢測NSCLC患者與健康對照組人群血清內IL-17表達及IL-21濃度，酶聯免疫吸附試劑盒由美國R&D公司提供，IL-17最低檢測限度為0.1 pg/ml，IL-21最低檢測限度為1.0 pg/ml，檢測期間所有操作均應按試劑盒嚴格進行。

三、統計學方法

結 果

一、兩組外周血Th17細胞及其相關因子表達結果

研究組Th17細胞比例、IL-17水平、IL-21表達高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 研究組與健康對照組外周血Th17細胞及其相關因子表達比較

二、研究組Th17細胞及其相關因子與性別、年齡的結果

不同性別、不同年齡間NSCLC患者Th17細胞及其相關因子水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 研究組Th17細胞及其相關因子與性別、年齡的關系

三、不同病理分期NSCLC患者Th17細胞及其相關因子水平結果

隨著腫瘤分期進展，NSCLC患者外周血Th17細胞比例，IL-17、IL-21表達均呈升高趨勢，各分期間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同病理分期NSCLC患者Th17細胞及其相關因子水平比較

四、Th17細胞及其相關因子與腫瘤分期相關性結果

Th17細胞比例、IL-17、IL-21表達與NSCLC患者腫瘤分期呈正相關(r>0，P<0.05)，見表4。

表4 NSCLC患者Th17細胞及其相關因子與腫瘤分期相關性分析

討 論

我國2014年腫瘤登記中心數據顯示，肺癌患病人數為78.1萬例次，其中有62.6萬例因病死亡，在我國惡性腫瘤中居首位[14-15]。雖然放化療、手術、靶向藥物等惡性腫瘤疾病治療技術在不斷進步，但肺癌患者5年生存率仍較低，造成巨大的經濟與社會負擔[16-17]。肺癌的發生、發展與機體免疫平衡息息相關，在細胞免疫方面，主要是CD4+T淋巴細胞起到關鍵作用[18-19]。

NSCLC的發生發展與免疫功能狀態有密切相關性，細胞免疫的效應細胞以T淋巴細胞為主，其中CD4+T淋巴細胞參與了機體免疫應答的各個階段，是免疫調節不可或缺的關鍵環節[20-21]。Th17細胞是近年來最新發現CD4+T淋巴細胞的一種，在先天性免疫與獲得性免疫中均有著至關重要的作用，分泌IL-17是其主要特點，分化成熟的Th17細胞參與了腫瘤的發生與發展，決定了疾病的轉歸及預后[22-23]。研究顯示，相較于健康人群，NSCLC患者外周血內Th17細胞顯著升高[24]。在NSCLC中以肺腺癌較多見，約為全部肺癌組織類型的43.3%[25]。但因本文主要觀察Th17細胞相關因子在不同病理分期NSCLC中的表達及意義，故并未對不同病理類型NSCLC Th17細胞表達進行對比研究，還應在未來進一步研究。結果顯示，較對照組，NSCLC組患者外周血Th17細胞比例、IL-17表達、IL-21表達均明顯升高，這與范恒建等[26]研究結果基本一致，提示Th-17細胞也參與了NSCLC的發生與發展，IL-17、IL-21等Th-17細胞相關因子可能與肺癌的發病及病情進展有關。迄今為止，Th17細胞在NSCLC疾病發生發展中的作用仍有爭議性，一方面腫瘤細胞內IL-17過度表達可加快新生血管生成及腫瘤的生長，此時若給予肺癌小鼠模型IL-17A注射及IL-17A阻斷能夠有效抑制腫瘤轉移；另一方面，在肺癌小鼠模型被敲除IL-17基因后其轉移情況更為明顯[27-28]。

IL-17是能夠促進血管內皮細胞遷移與內皮細胞形成的因子，同時該因子還能促進腫瘤內間質細胞與腫瘤細胞分泌出多種促血管生成細胞因子，如趨化因子、血管內皮生長因子等，加速腫瘤的轉移、浸潤與生長[29-30]。IL-21是Ⅰ型細胞因子，主要經活化CD4+T淋巴細胞、Th17細胞所分泌，與白細胞介素-4、白細胞介素-7等細胞因子擁有相同的γ鏈受體，其生物學功能廣泛，參與獲得性與天然的免疫反應，能夠加速淋巴細胞的增殖，增強NK細胞與CD8+T淋巴細胞的細胞毒性作用，推動B細胞分化；該因子主要經Th17細胞所分泌，反過來還對Th17細胞起到調節之效[31-32]。為進一步明確Th17細胞相關因子表達與NSCLC病理分期的相關性，本文納入我院近幾年收治41例NSCLC患者，根據其病理分期結果檢測并對比Th17細胞相關因子水平，結果顯示，隨著NSCLC病理分期增加，患者外周血Th17細胞比例、IL-17及IL-21水平表達呈上升趨勢，說明Th17細胞相關因子水平變化可能與NSCLC的發生發展有關。進一步行相關性分析檢驗發現，Th17細胞比例、IL-17表達、IL-21表達與NSCLC病理分期呈正相關，也間接證實了Th17細胞相關因子在NSCLC中可能的指導價值。

綜上所述，NSCLC患者外周血中Th17細胞呈高表達，且隨病情的進展不斷升高，檢測NSCLC患者外周血Th17細胞及其相關因子水平，對病情的判斷及了解患者機體免疫功能有重要的臨床意義。