T-SPOT.TB聯合血清25-(OH)D3、LL-37診斷肺結核合并糖尿病的價值分析

宋 韜 付洪義 李莉娟 耿書軍 侯莉莉 康冠楠

據統計，我國每年約有100萬新發結核病(tuberculosis, TB)，全球每年140萬 TB相關的死亡病例中，中國和印度總占比高達40%，防控形式仍十分嚴峻[1]。尤其是近年來，伴隨糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率的逐年增加，結核病患病率呈回升趨勢，極大威脅全球TB防控[2]。肺結核(pulmonary tuberculosis, PTB)則是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染后引起的肺組織受損，若無有效控制則可持續進展并累及多個系統及器官，而較單純PTB患者，合并DM的患者預后更差，加之其結核中毒癥狀不典型，診治難度也更大[3-6]。此類患者通常同時合并滲出性、增生性及干酪樣壞死病變病理生理基礎，影像學可見厚壁空洞這一特異性影像表現；但空洞形成又受機體免疫功能、病原體變態反應能力等多因素影像，合并DM時可增加空洞型病變發生率，影像學輔助檢查特異性不佳；加之DM患者機體環境于MTB增長繁殖有益，因此合并DM的PTB患者痰檢結果具較高的假陽性率，難以獲得優勢診斷效能[7-8]。結核菌素實驗用于PTB的臨床診斷同樣存在局限性，其不僅受卡介苗接種因素影響，并與非MTB存在交叉免疫現象；而支氣管鏡、肺組織活檢皆為有創檢查[9-10]。較傳統痰檢、結核菌素實驗及有創支氣管鏡、肺組織活檢，結核桿菌T細胞斑點實驗(T-cell spot of tuberculosis, T-SPOT.TB)診斷PTB雖具一定優勢，但合并DM的PTB患者T-SPOT.TB檢測極易出現假陰性，且當前針對性研究其診斷PTB合并DM患者的臨床報道少見[11]。因此，本文回顧性分析探析T-SPOT.TB檢查聯合血清25-羥基維生素D3[25-dihydroxycholecalciferol D3, 25-(OH)D3]、LL-37診斷PTB合并DM的價值，為PTB合并DM的臨床診斷提供新思路，報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2015年1月至2018年12月在本院行T-SPOT.TB實驗及血清25-(OH)D3、LL-37檢測的340例疑似PTB患者；其中121例單純PTB患者納入PTB組，男72例，女49例，年齡27～71歲，平均年齡55.87歲；97例PTB合并DM患者納入PTB-DM組，男45例，女52例，年齡30～70歲，平均年齡56.07歲；另122例排除MTB感染患者納入對照組，男69例，女53例，年齡28～72歲，平均年齡55.97歲，包括41例肺癌、39例淋巴瘤、42例胸膜間皮瘤。

納入標準：①PTB診斷標準參照《結核病》，有肺病理組織活檢、病原學檢查結果佐證[12]；②DM診斷標準參照《美國糖尿病協會糖尿病完全指南》[13]；③對照組病理組織活檢排除MTB感染，且非DM，并有治療后影像學隨訪記錄佐證。

排除標準：①病理組織活檢證實合并良惡性腫瘤疾病的PTB患者；②合并自身免疫性疾病；③病歷資料顯示近3個月內補充過維生素D、皮質激素、利尿劑；④肺炎；⑥心、腦、肝或腎器官病變；⑤過敏性疾病。

二、研究方法

1.T-SPOT.TB檢查：肝素鈉抗凝試管采集晨間4 ml外周靜脈血，加入淋巴細胞分離液后分離外周血，重復離心操作3次后取10 μl樣本細胞加入計數板計數活細胞數目，并制備稀釋液；在培養板中依次加入陽性對照液、特異性抗原培養濾液蛋白10(culture filtrate protein, CFP10)、6000早期分泌性抗原靶(early secreted antigenic target-6 kD Antigen, ESAT-6)、陰性對照液，均50 μl，每孔加入含2.5×105個細胞的細胞稀釋100 μl，37 ℃、5%CO2條件下孵育16 h后，在培養板中加入50 μl酶標抗體液，4 ℃孵育1 h后取出培養板，加入50 μl底物液，室溫避光孵育7 min，蒸餾水終止反應，烘干處理后應用自動計數儀(ELISPOT讀板儀)計數斑點形成細胞(sphere forming cells, SFCs)數量。陰性對照孔斑點數為0～5，ESAT-6孔或CFP-10孔斑點數與陰性對照孔斑點數的差值≥6；或陰性對照孔斑點數為6～10，ESAT-6孔或CFP-10孔斑點數是陰性對照孔斑點數的2倍及以上則判定為“有反應性”；否則為“無反應性”；若出現陽性對照孔斑點數<20，或陰性對照孔斑點書>10則定義為“不確定”。

2.血清25-(OH)D3檢測：分離膠促凝血試管采集晨間靜脈血2 ml，分離膠促凝血試管采集，20 min內離心操作，1 500轉離心15 min，分離血清后-70 ℃保存，液相色譜-串聯質譜法檢測血清25-(OH)D3水平，檢測設備為API4000液相色譜-串聯質譜儀(美國AB公司)。

3.LL-37檢測：EDTA抗凝血試管采集晨間空腹靜脈血2 ml，4 ℃條件下離心500轉，15 min，吸收血漿后再次1 500轉離心15 min，提取血清至聚丙烯管，-70 ℃保存，固相酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測LL-37水平，試劑購自Hycult biotech。

三、統計學方法

結 果

一、T-SPOT.TB檢測診斷結果

1.T-SPOT.TB檢測對PTB的診斷價值分析：340例疑似PTB患者T-SPOT.TB檢測未見“不明確”現象；121例確診PTB患者中，T-SPOT.TB檢測“有反應性”104例，準確率85.9%(104/121)；97例PTB合并DM患者中，T-SPOT.TB檢測“有反應性”73例，準確率75.2%(73/97)；對照組中T-SPOT.TB檢出“有反應性”28例，準確率77.0%(94/122)；共檢出195例提示陽性。T-SPOT.TB診斷PTB的總敏感度為76.6%、特異度為77.0%、準確率76.8%、陽性預測值85.6%、陰性預測值64.8%、kappa 0.515，一致性一般，見表1。

表1 T-SPOT.TB檢測對PTB的診斷價值分析

2.抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內SFCs數量診斷PTB合并DM的ROC曲線分析：對照組、PTB組、PTB-DM組抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內SFCs 比較差異均有統計學意義(P<0.001)，且PTB-DM組抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內SFCs>PTB組>對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；ROC曲線分析顯示，抗原CFP10及抗原ESAT-6孔SFCs AUC分別為0.871(95%CI：0.829～0.914)、0.872(95%CI：0.835～0.909)；抗原CFP10孔cut-off為16.13 SFCs/2.5×105PBMC，診斷PTB合并DM的敏感度為84.5%，特異度為71.6%；抗原ESAT-6孔cut-off為14.80SFCs/2.5×105PBMC，診斷PTB合并DM的敏感度為84.5%，特異度為72.4%；抗原CFP10、抗原ESAT-6聯合診斷時AUC為0.931(95%CI：0.904～0.958)，診斷敏感度為83.5%，特異度為87.2%。各組抗原CFP10、抗原ESAT-6原值比較，見表2、圖1。

表2 各組抗原CFP10、抗原ESAT-6原值比較

圖1 抗原CFP10、抗原ESAT-6診斷PTB合并DM的ROC曲線分析

二、各組血清25-(OH)D3及LL-37水平檢測結果

1.血清25-(OH)D3及LL-37水平檢測結果：對照組、PTB組、PTB-DM組血清25-(OH)D3及LL-37水平比較差異均有統計學意義(P<0.001)；且PTB-DM組血清25-(OH)D3PTB組>對照組；差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組血清25-(OH)D3及LL-37水平比較

2.血清25-(OH)D3、LL-37對PTB合并DM的診斷價值分析：ROC曲線分析顯示，血清25-(OH)D3、LL-37 AUC分別為0.630(95%CI：0.570～0.690)、0.653(95%CI：0.575～0.732)，以25-(OH)D3cut-off為18.06 ng/ml，診斷PTB合并DM的敏感度為90.7%，特異度為33.3%；以LL-37 cut-off為59.71 ng/ml，診斷PTB合并DM的敏感度為45.4%，特異度為91.4%，見圖2、3。

圖2 25-(OH)D3 ROC曲線分析

圖3 LL-37 ROC曲線分析

三、T-SPOT.TB聯合血清25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM的結果

經ROC曲線分析，T-SPOT.TB、血清25-(OH)D3、LL-37三種檢測任意組合方式診斷PTB合并DM均有良好的診斷效能，T-SPOT.TB聯合25-(OH)D3、LL37診斷時AUC最大，為0.933%，特異度最佳，但敏感度略低于T-SPOT.TB聯合25-(OH)D3、T-SPOT.TB聯合LL-37診斷。T-SPOT.TB聯合血清25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM的價值見表4。

表4 T-SPOT.TB聯合血清25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM的價值

討 論

合并DM的PTB患者早期并無特異性臨床癥狀，且DM患者多存在代謝障礙、免疫低下等特點，其并發癥較多，兩種病變密切相關并又相互作用，不僅臨床癥狀更為復雜，亦可使MTB感染癥狀不典型，極易誤漏診，貽誤治療[14-15]。因此，準確診斷尤為重要。而當前診斷PTB的方式雖較多，如影像學輔助檢查、痰檢、結核菌素實驗、支氣管鏡、肺組織活檢等，但又各具一定局限性[16-17]。T-SPOT.TB作為診斷TB的新興技術，其可通過檢測結核特異性抗原刺激后產生的γ-干擾素T細胞數量判斷是否感染MTB，較傳統痰培養、痰涂片，其在敏感度及特異度上優勢顯著，且無創；但γ-干擾素的量、抗原數量受疾病活動、個體免疫等多因素影響[18-19]。尤其是合并DM的PTB患者，其多存在免疫功能低下，機體細胞免疫應答弱，其受抗原活化后產生γ-干擾素的T細胞數量也會隨之減少，極易出現“無反應性”，導致誤漏診[20-21]。

本文回顧性分析340例疑似PTB患者的T-SPOT.TB檢測結果顯示，其診斷PTB的總敏感度為76.6%、特異度為77.0%、準確率76.8%、陽性預測值85.6%、陰性預測值64.8%、kappa 0.515，一致性一般；而121例確診PTB患者中，T-SPOT.TB檢測準確率85.9%；而97例PTB合并DM患者、對照組中，T-SPOT.TB檢測準確率僅為75.2%、77.0%，進一步驗證，對合并DM的PTB患者，單一T-SPOT.TB診斷效能不佳。這與石學萍等[22]的報道相似，其采集700例疑似PTB患者進行T-SPOT.TB檢測亦未獲得理想診斷效能。而藺景雙等[23]則報道T-SPOT.TB診斷PTB的敏感度及特異度分別高達95.1%、91.3%；分析或因其報道所納入研究對象均有典型肺結核中毒癥狀及影像特點有關。由此亦可見，探究T-SPOT.TB在PTB中的臨床應用仍有待持續補充及完善，也體現本次回顧性分析的必要性。

鑒于此，本文將PTM合并DM設為狀態變量，以T-SPOT.TB檢測抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內SFCs為檢驗變量繪制ROC曲線，結果顯示，抗原CFP10及抗原ESAT-6孔SFCs對TB合并DM均有一定診斷預測價值，且以16.13 SFCs/2.5×105PBMC、14.80 SFCs/2.5×105PBMC為cut-off聯合診斷時，敏感度、特異度最佳，分別為83.50%、87.20%；較單純依據抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內SFCs與陰性對照孔差值等診斷，其診斷效能雖有一定提升，但仍一定誤漏診現象。

25-(OH)D3則是維生素D的活化形式，其作為免疫調節劑，是維持機體免疫穩定平衡的重要物質，且多項研究均證實，維生素D缺乏在DM、TB的發生發展中占重要地位，或可導致疾病進展風險成倍增加[24-27]；Sinha等[28]亦報道，維生素D缺乏可增加TB易感。而LL-37則是中性粒細胞、單核細胞等多個免疫細胞合成的內源性抗菌肽，不僅對維生素D有依賴性，亦可對MTB發揮拮抗作用[29-31]。結果顯示，PTB-DM組血清25-(OH)D3PTB組>對照組；戰云飛等[32]也有類似報道，并指出PTB患者LL37上升或與機體代償反應相關，認為LL37或可成為PB診斷的新型生物標志物，但未針對LL-37的診斷價值進行分析。ROC曲線分析顯示，LL-37 AUC 為0.653，提示其對PTB合并DM有一定診斷預測價值，以59.71 ng/ml為cut-off，其診斷PTB合并DM的敏感度雖僅為45.4%，但特異度高達91.4%；而血清25-(OH)D3AUC則為0.630，以18.06 ng/ml為cut-off，其診斷PTB合并DM的敏感度高達90.7%，但特異度較低，僅為33.3%；這也提示單一25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM存在一定局限，而25-(OH)D3、LL-37聯合診斷時，診斷效能有一定改善，AUC上升為0.701%，但敏感度及特異度仍較低，分別為58.8%、76.5%。本文結果顯示，T-SPOT.TB、血清25-(OH)D3、LL-37三種檢測任意組合方式診斷PTB合并DM均有良好的診斷效能，T-SPOT.TB聯合25-(OH)D3、或聯合LL-37診斷時敏感度度及特異性無顯著差異，但均顯著優于25-(OH)D3聯合LL-37診斷；而進一步將T-SPOT.TB與25-(OH)D3、LL37聯合診斷時，AUC值上升至0.933，敏感度、特異度分別高達79.4%、92.2%，與T-SPOT.TB聯合25-(OH)D3、或聯合LL-37比較，其敏感度雖有一定下降，但差異無統計學意義。

綜上所述，T-SPOT.TB與25-(OH)D3、LL37聯合診斷PTB合并DM可發揮最佳診斷效能，且優于任意兩兩組合方式，值得臨床重視；但基于本文樣本量相對狹窄，且未考慮疑似肺結核患者肺野受累情況、未納入對照組、未進一步明確糖尿病類型及病程等，仍存在一定局限性，T-SPOT.TB與25-(OH)D3、LL37在PTB合并DM患者中的診斷價值仍有待采集更大樣本量設計更嚴謹的臨床研究。