肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1表達與EGFR基因突變的相關性分析

瓦熱斯江·衣不拉音 吳振華 孫 偉 阿布力米提·阿布來提

肺腺癌因缺乏特異性診斷技術，加之早期無典型癥狀及表現，多數患者在確診時已經發展至中晚期，失去最佳的手術機會，即便是接受手術治療，根除率也較低[1]。目前，肺癌的發病機制不明確，多認為與職業暴露、特定的基因突變等因素有關[2-3]。可見為肺腺癌患者找到新的且療效明確的治療手段意義重大。當前已經發現的肺腺癌常見變異基因位點有鼠肉瘤病毒基因、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)等，其中EGFR基因突變的發生被認為是肺部惡性腫瘤發生與發展的主要遺傳學因素[4-5]。但EGFR基因突變檢查對技術、腫瘤組織獲取、實驗條件等均有較高的要求，目前可以展開基因檢測的地區相對有限，開展難度大[6-7]。故找到一種可以早期評估肺腺癌患者EGFR基因突變情況的理想指標尤為關鍵。研究顯示，胰島素樣生長因子-1受體(insulin like growth factor-1 receptor, IGF1R)在細胞生命活動中有著關鍵作用，參與了腫瘤細胞的生長與凋亡，在非小細胞肺癌組織樣本中呈高表達[8-9]；Cezanne-1是一種有著去泛素化酶，與A20酶的序列相似，研究發現，其在腫瘤組織樣本中呈過表達，且研究認為這種Cezanne-1過表達與增強EGFR信號通路作用及抑制EGFR降解有關[10-11]。故推測Cezanne-1表達與EGFR基因突變相關，但目前相關的研究并不多見。本文探討IGF1R、Cezanne-1表達用于預測EGFR基因突變風險的價值，現報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2017年3月至2019月4月醫院收治的符合入選標準且得到明確肺腺癌腫瘤組織，并經病理科診斷明確為肺腺癌的患者56例，將其納入研究組。其中男36例，女20例；年齡34～80歲，平均年齡53.11歲；吸煙者31例；病理分期：參照2009國際肺癌研究學會公布肺惡性腫瘤TNM分期(第7版)[12]，包括Ⅰ期3例，Ⅱ期13例，Ⅲ期29例，Ⅳ期11例。納入同期在醫院接受手術治療并在術中獲得病灶組織的51例肺部良性病變患者，將其作為對照組。其中男33例，女18例；年齡35～80歲，平均年齡50.27歲；吸煙者22例。全部納入的患者均有明確的病理學結果，并獲得病灶組織樣本，病例組患者還獲得少量癌旁組織樣本；排除合并其他腫瘤疾病的患者、合并其他免疫性疾病的患者、合并其他器質性疾病的患者、合并其他重要臟器功能不全的患者。本項目的實施得到醫院倫理委員會的批準，全部納入的患者及其家屬簽署知情同意書。

二、研究方法

病理組織獲得方法包括手術直接切除、纖支鏡取得、CT輔助定位經皮肺穿刺取得。包括肺癌組織、癌旁組織、肺部良性病變組織。組織樣本IGF1R、Cezanne-1、EGFR表達情況均采用免疫組化法測定。免疫組化切片、烤片等各個步驟使用的儀器均由Leica公司提供。具體免疫組化步驟：(1)標本的處理：固定、包埋、切片、撈片、烤片；(2)檢測主要步驟：標本脫蠟、水化、抗原修復、一抗孵育、免疫組化試劑盒使用、顯色、自來水沖洗、復染、脫水、透明、封片、讀片。各指標陽性判讀：經低倍鏡、高倍鏡觀察并讀片，由醫院兩名有自身免疫組化閱片經驗的醫師讀片，在著色的病理組織中，高倍鏡下至少5個各異的染色區域，按照細胞膜、細胞核或細胞質著色的程度來評價陽性細胞的百分率：著色細胞占比≤10%視為陰性，著色>10%則視為陽性表達(其中包括>10%～25%：弱陽性﹢；>25%～75%視為中等陽性﹢﹢；>75%視為強陽性﹢﹢﹢)。

EGFR基因突變檢測：樣本取樣方法一致。該檢測所用主要儀器與試劑由德國凱杰公司提供，包括EFGR基因突變檢驗試劑盒、熒光定量PCR儀等。取得組織樣本之后使用福爾馬林固定，石蠟包埋之后切片，離心制作并取DNA，進行熒光定量分析操作，各個操作步驟均需嚴格遵照試劑盒說明書進行。采用探針擴增阻滯突變系統(等位基因特異聚合酶鏈反應)檢測，設置合適的反應條件，擴增后的產物使用熒光定量PCR儀器定量分析，主要的基因突變包括EGFR18、EGFR Exon19、EGFR Exon20、EGFR Exon21等基因突變情況。

三、統計學方法

應用SPSS20.0統計學軟件處理數據，以百分比表示計數資料，用χ2檢驗或秩和檢驗進行組間比較，等級相關采用Spearman相關性檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

一、EGFR基因突變檢出結果比較

肺腺癌組織EGFR基因突變陽性檢出率高于癌旁組織及肺部良性病變組，差異有統計學意義(P<0.05)，癌旁組織與肺部良性組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組EGFR基因突變陽性檢出率比較

二、研究組EGFR突變患者與未突變患者的臨床特征比較結果

EGFR基因突變的肺腺癌患者與其他未檢出基因突變的肺腺癌患者的性別、年齡、吸煙史、TNM分期等臨床特征比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

三、IGF1R、Cezanne-1陽性表達檢出率比較結果

肺腺癌組織檢出IGF1R、Cezanne-1陽性率高于癌旁組織與肺部良性病變組織，差異有統計學意義(P<0.05)；癌旁組織與肺部良性疾病比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 IGF1R、Cezanne-1陽性表達檢出率比較

四、不同EGFR基因突變組織中IGF1R、Cezanne-1陽性檢出率比較結果

EGFR基因突變的肺腺癌組織中檢出的IGF1R、Cezanne-1陽性率均高于未檢出EGFR基因突變的組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同EGFR基因突變肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1陽性檢出率比較

五、肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1表達與EGFR基因突變的相關性分析結果

經等級資料Spearman相關性檢驗結果顯示，IGF1R、Cezanne-1表達與EGFR基因突變之間均呈正相關(r>0，P<0.05)，見表5。

討 論

EGFR屬于人類表皮生長因子受體(HER/erbB)家族，是一種蛋白腦氨酸激酶受體，主要由原癌基因c-erb-1編碼表達，是跨膜糖蛋白受體的一種[12-13]。人類EGFR基因存在于七號染色體p13～q22之間，共5 460 bp，其中包含28個外顯子，研究證實EGFR基因活化之后可以進一步啟動轉錄系統，繼而編碼相關蛋白的表達，對細胞的異常增殖及分化產生直接刺激，是腫瘤發生與發展的決定性因子之一[14-15]。在非小細胞肺癌患者中，EGFR突變激活也可能是導致癌變的重要因素[16]。可考慮將突變結果的檢出指導臨床治療。

本文結果顯示，較癌旁組織與肺部良性組織，肺腺癌組織檢出的EGFR基因突變率最高，為57%，較國外研究的30%～50%偏高，這可能與基因突變具有種族差異、人群差異等因素有關[17]；此外，因本文屬于回顧分析，獲得的病理組織切片可能并非新鮮的組織切片，長時間的保存，可能受其他因素影響，會導致檢查結果出現偏差，還需要在未來進一步行前瞻性的研究加以證實并說明。且癌旁組織與肺部良性組織比較未見明顯差異；同時對比了EGFR基因突變與未突變的肺腺癌患者的臨床特征結果顯示，二者間的臨床特征比較均無明顯差異，可見腫瘤分期、性別、年齡等并不會對肺腺癌患者的EGFR基因突變產生影響，將突變的結果用于指導治療有一定價值。但需要注意的是，EGFR基因突變的檢查對實驗室、操作人員技術、儀器等均有較高要求，在國內仍有許多醫療機構無法滿足該要求，故找到一種對肺癌患者EGFR基因突變有相對理想的預測價值的實驗室指標，對間接預測肺癌患者EGFR基因突變、指導治療有著關鍵意義，這也是現階段臨床研究的重難點。

既往，有研究采用血清學檢查的方法，旨在找到可以準確預測腫瘤患者EGFR基因突變的血清學標志物，但大量的研究結果均表明了，血清學標志物的使用雖有一定預測價值，但因肺癌具有異質性，加之血清學受影響因素較多，故診斷的特異性不高[18-19]。IGF1R是受體腦氨酸激酶受體重要成員之一，也是IGF信號通路關鍵組成部分，研究證實，IGF在腫瘤細胞增殖與凋亡過程中起到關鍵作用[20-21]。隨著臨床對該受體在腫瘤疾病中的作用的不斷深入研究，其相關的研究熱點現已發展至IGF1R泛素化、去泛素化的動態平衡情況[22]。研究指出，IGF1R泛素化及去泛素化進程在腫瘤的生存、死亡中起到關鍵的調節效果，IGF1R的泛素化過程主要是對IGF1R受體內產生下調之效，這一調節過程與EGFR的泛素化動態平衡相關，此外EGFR還可以誘導泛素化降解[23-24]。故推測EGFR基因突變可能與IGF1R泛素化及去泛素化進程的改變有關。同泛素化作用相反，去泛素化酶主要經去泛素化來維持目標蛋白穩定[25]。Cezanne-1是一種主要在細胞信號通路信號傳遞期間起到決定性作用的主要去泛素化酶，作為去泛素化酶家族主要成員之一，其在細胞生命活動過程中起到具有決定意義的調節之效[26-27]。研究證實，Cezanne-1一旦缺失將造成HIF-1α泛素化過程改變，并經非蛋白酶體途徑加速HIF-1α的降解[28]；此外，Cezanne-1還被證實可以對HIF-2α表達有調節之效，若細胞內Cezanne-1含量降低，細胞周期在進入到S期與M期這一過程便會發生異常[29]。Pareja等[30]在2012年的研究中采用RNA篩查的方法，發現了Cezanne-1與EGFR之間的聯系，Cezanne-1是EGFR去泛素化酶，可以在信號通路內對受體的降解產生抑制來促進EGFR信號傳遞的增強。故推測，測定細胞組織內Cezanne-1表達可能對預測EGFR基因突變有一定價值。

本文結果顯示，肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1陽性表達率高于癌旁組織與肺部良性組織，且癌旁組織與肺部良性組織間比較未見差異，初步判斷Cezanne-1與IGF1R在肺腺癌組織中表達的特異性。進一步分析肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1陽性表達與EGFR基因突變的相關性結果顯示，三者間兩兩呈正相關。由上述結果可以推測，IGF1R、Cezanne-1導致的EGFR基因突變可能與肺腺癌的發生發展有關。但因研究屬于回顧性，且為了避免肺癌異質性帶來的影響，本文僅納入了肺腺癌，加之納入的樣本量相對較少，且國內外既往無較多的研究結果可作為循證支持依據，故結果與結論的真實性、可靠性均需要進一步在未來行大量的前瞻性、大樣本、不同肺癌病理分型的實驗研究加以證實。

綜上所述，肺腺癌組織內IGF1R、Cezanne-1多呈過表達，EGFR基因突變率較其他正常組織高，且這種IGF1R、Cezanne-1的過表達與EGFR基因突變明顯相關。