姜黃素對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響

譚 丹 曾小琴 徐 偉 陳 戩 周人杰

非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的75%～85%，其特征是極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[1-2]。大部分患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，因此深入探討肺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，可為非手術(shù)治療提供一些線索[3-5]。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)姜黃素(Curcumin)是一種天然多酚類色素，能抗炎、抗微生物等，藥理作用豐富，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲方面也有著顯著成效[6-23]。本文觀察濃度梯度的姜黃素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，以及對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、E型鈣黏蛋白(E-cadherin)以及N型鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達(dá)影響，從而探索A549細(xì)胞侵襲、遷移的機(jī)制，為臨床上肺癌的治療提供線索。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

姜黃素購(gòu)自廣州盛德生物公司(粉劑，95%純度)。EGFR、E-cadherin、N-cadherin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。0.25%胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM培養(yǎng)基(高糖型)均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell小室、基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司。人肺癌A549細(xì)胞株和人正常肺上皮細(xì)胞由陸軍(第三)軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.臺(tái)盼藍(lán)染色：取5×104個(gè)正常人肺上皮細(xì)胞接種于6孔板中，孵箱中培養(yǎng)過夜。加入濃度0，10，20，40，80 μg/ml的姜黃素(其中0 μg/ml為對(duì)照組)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取細(xì)胞懸液，加入臺(tái)盼藍(lán)溶液以9︰1的比例混勻著色，各組細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，顯微鏡下計(jì)數(shù)死細(xì)胞與活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算不同藥物濃度下細(xì)胞病死率。

2.MTT實(shí)驗(yàn)：取1×104/ml 的A549接種于96孔板中，每孔約3×103個(gè)細(xì)胞，放置于孵箱中培養(yǎng)。加入姜黃素溶液100 μl，終濃度分別為0、10、20、40、80 μg/ml，(其中0 μg/ml為對(duì)照組)，每組設(shè)5個(gè)平行孔，放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，加入DMSO振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處吸光度，計(jì)算增殖率，再算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

3.劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞重懸、均勻等量接種于6孔板上，孵箱培養(yǎng)鋪滿細(xì)胞，去上清，選擇細(xì)胞密度相當(dāng)?shù)?處，用10 μl 的槍頭作劃痕，各孔分別加入含0、10、20、40 μg/ml 姜黃素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，記錄劃痕寬度并計(jì)算每孔平均值，最后計(jì)算平均劃痕愈合率。

4.Transwell實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)采用8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室。將生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)，以5×104個(gè)接種于上室基質(zhì)膠上，并在各上室中分別加入含0、10、20、40 μg/ml 姜黃素培養(yǎng)液200 μl，下室加含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液700 μl，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定上室外面細(xì)胞，用0.05結(jié)晶紫溶液染色30 min，PBS洗3次，用倒置顯微鏡(10×10)倍視野下，各上室隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察穿過膜的細(xì)胞，照相并計(jì)數(shù)，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5.Werstern blot實(shí)驗(yàn)：用0、10、20、40 μg/ml姜黃素處理各組細(xì)胞后，懸浮并收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2次，棄上液，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min，1 000 r/min離心10 min，收集上清液并測(cè)定蛋白量。配置電泳凝膠，等量上樣，蛋白質(zhì)電泳分離，凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗封孵育過夜后復(fù)溫2 h，TBST洗膜后放入二抗中孵育2 h，洗膜后暗室膠片發(fā)光、顯影、定影，最后掃描并記錄。用Quantity One 軟件進(jìn)行灰度值分析，用目的蛋白的灰度值與B-actin的灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、姜黃素對(duì)正常肺上皮細(xì)胞的不良反應(yīng)結(jié)果

姜黃素濃度在0～40 μg/ml時(shí)細(xì)胞病死率<10%，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可見姜黃素對(duì)正常肺上皮細(xì)胞毒性小，見圖1。

圖1 姜黃素對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞病死率的影響；注：*P<0.01，與對(duì)照組比較

二、姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖有抑制作用

MTT法顯示姜黃素濃度升高細(xì)胞懸液分光光度值(A570值)越低，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明姜黃素抑制A549細(xì)胞增殖呈濃度依賴，見表1、圖2。

表1 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖2 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；注：*P<0.05，#P<0.01，與對(duì)照組比較

三、姜黃素對(duì)A549細(xì)胞遷移力的抑制

與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的姜黃素作用于A549細(xì)胞12 h和24 h后，對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移愈合能力有抑制作用(P<0.01)，且呈藥物濃度依賴性(P<0.01)，見圖3。

圖3 A549細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)光鏡照片(HE×100)；注：*P<0.01，與對(duì)照組比較；#P<0.01，與較低劑量組比較

四、姜黃素對(duì)A549細(xì)胞侵襲力的抑制

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度姜黃素作用A549細(xì)胞后，細(xì)胞在體外穿透模數(shù)量(侵襲力)有明顯的減少(P<0.01)，且呈濃度依賴性(P<0.01)，見圖4。

圖4 A549細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)光鏡照片(HE×100)；注：*P<0.01，與對(duì)照組比較；#P<0.01，與較10 μg劑量組比較

五、Werstern blot檢測(cè)EGFR、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)

Werstern blot檢測(cè)結(jié)果顯示姜黃素抑制A549細(xì)胞中EGFR及N-cadherin蛋白表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)能上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，其作用均呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot顯示各組中EGFR、E-cadherin以及N-cadher蛋白的表達(dá)變化注：*P<0.01 vs.1; #P<0.01 vs 2; ∧P<0.01 vs.3

討 論

近年來肺癌躍居腫瘤排名的首位，許多患者發(fā)現(xiàn)晚，已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。放化療不僅不良反應(yīng)大，且對(duì)于非小細(xì)胞肺癌作用十分有限。而靶向藥物受眾小，且基因突變檢出率有限，肺癌患者5年生存率低，預(yù)后差，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生頻繁[24-26]。是否有一種價(jià)格低廉受眾廣泛的方法能夠有效控制肺癌？也許從肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制入手，可以找到有效的治療方法。姜黃素是從植物姜黃的根莖提取的一種有效的廣譜抗腫瘤成分，在結(jié)直腸腫瘤、泌尿系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)腫瘤均有研究，研究表明姜黃素對(duì)肺癌也有抑制作用，是通過上調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，從而使細(xì)胞線粒體外膜孔道開放，誘導(dǎo)凋亡[27-30]。本文MTT實(shí)驗(yàn)也說明姜黃素抑制A549細(xì)胞增殖，應(yīng)證了這一理論，這一理論僅能解釋A549細(xì)胞增殖的抑制，卻不能很好的解釋對(duì)侵襲和遷移能力的影響，本文在劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)中證明了姜黃素對(duì)A549細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制，且對(duì)EGFR、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞在各種因子調(diào)控下，細(xì)胞間緊密連接消失，失去細(xì)胞極性，從而獲得游走能力，具有了間質(zhì)細(xì)胞的特性，能在脈管及組織間隙移動(dòng)，這種上皮細(xì)胞失去連接分化，向間質(zhì)細(xì)胞變化的過程叫做上皮間轉(zhuǎn)[11]。而腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力就與這種失黏附的轉(zhuǎn)變有密切關(guān)系，分子表型主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白如E-cadherin蛋白的表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)N-cadherin蛋白表達(dá)的增加[10]。頭頸部腫瘤、卵巢癌、乳腺癌等發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移都與上皮間轉(zhuǎn)EMT有著密切關(guān)系，且逆轉(zhuǎn)EMT后，腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力下降顯著[24-26]。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜黏蛋白，是原癌基因CerbB-1的表達(dá)產(chǎn)物。在健康人肺組織中EGFR低表達(dá)，而在大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中存在高表達(dá)情況[8-9]。且在有淋巴轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵犯的患者組中EGFR的表達(dá)明顯高于淋巴、神經(jīng)侵犯陰性的患者組[10]。EGFR能與胞外配體結(jié)合，激活多條亞細(xì)胞通路，不僅能參與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，也使癌細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)員效應(yīng)，發(fā)生肺癌的轉(zhuǎn)移。因此EGFR的過度表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。

綜上所述，姜黃素(Curcumin)是一種天然多酚，植物藥成分具有來源廣泛，價(jià)格低廉，不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，為該種成分走向臨床提供了很好的先決條件[16]。目前在醫(yī)學(xué)多領(lǐng)域?qū)Υ顺煞侄加猩钊胙芯浚⑶以诳鼓[瘤方面已有研究顯示姜黃素對(duì)結(jié)直腸腫瘤、泌尿生殖腫瘤有抑制作用，還能抑制皮膚癌、口腔癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力，并且誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[17-18,31-32]。但在抑制腫瘤侵襲遷移方面機(jī)制的研究還沒有十分明確。本文發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)正常肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用小，而通過肺癌A549細(xì)胞作體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)肺癌A549細(xì)胞有抑制增殖的作用，可見姜黃素不是通過細(xì)胞毒作用無(wú)差別殺傷腫瘤和肺腫瘤細(xì)胞，并且姜黃素能明顯抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力，且呈藥物濃度依賴關(guān)系。藥物處理后EGFR、E-cadherin蛋白的上調(diào)，N-cadherin蛋白的下調(diào)，則提示其機(jī)制可能是通過抑制EGFR蛋白的表達(dá)及逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生而發(fā)揮作用。