誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查技術(shù)及應(yīng)用

陳華萍 王 子 李 瑾 徐 智 李 琦 王關(guān)嵩 張君國

誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查在我國已有10余年的發(fā)展，在疾病的診斷、治療和預(yù)后中均發(fā)揮了重要的作用。但目前，由于其操作流程在國際上尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，阻礙了該項(xiàng)目廣泛的開展，一定程度上也限制了該技術(shù)的發(fā)展。因此，本文結(jié)合自己的工作經(jīng)驗(yàn)，從方法學(xué)的角度對該項(xiàng)技術(shù)的檢測方法、應(yīng)用等方面進(jìn)行詳細(xì)的闡述，以期為后續(xù)開展的單位提供參考。

一、概述

誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類，即通過高滲鹽水霧化誘導(dǎo)患者咳痰，并檢測痰中各類細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)、中性粒細(xì)胞(Neu)、淋巴細(xì)胞(Lym)、單核-巨噬細(xì)胞(Mac)百分比。既往的研究表明，自然咳痰和誘導(dǎo)痰兩者結(jié)果并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以痰誘導(dǎo)過程針對不能自然咳出痰的患者[1]。在我們前期的研究中已證實(shí)誘導(dǎo)痰細(xì)胞檢查結(jié)果與FeNO值呈正相關(guān)(r=0.701)，表明二者在臨床診治中可以相互驗(yàn)證[2]。

二、誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查的操作方法

1.檢查所用器材和試劑包括：光學(xué)顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、烤片機(jī)、離心機(jī)、電子天平、瑞氏-姬姆薩染液。

2.操作流程：誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類雖在國內(nèi)不同醫(yī)院采用的方法均有不同，導(dǎo)致參考值間會出現(xiàn)一些差異，但總體趨勢一致，均能反應(yīng)患者痰中的真實(shí)水平。我院采用瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液染色方法，有操作過程簡潔，染色時(shí)間短，使患者盡早拿到結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。具體操作步驟如下：(1)利用3%～5%的高滲鹽水對不能咳出痰液的患者進(jìn)行霧化誘導(dǎo)咳痰；(2)待患者咳出痰液后，挑取粘稠或有痰栓的部分于4 ml的EP管內(nèi)進(jìn)行稱量，然后加入0.1% DTT于4 ml刻度線；(3)將盛有痰液的EP放置于37 ℃的水浴鍋內(nèi)進(jìn)行消化，期間不間斷搖勻EP；(4)待痰液完全消化后，吸取10 μl痰細(xì)胞懸液充池于牛鮑計(jì)數(shù)板內(nèi)，靜止3～5 min，鏡下計(jì)算計(jì)數(shù)板四個(gè)角內(nèi)16個(gè)大方格中細(xì)胞的平均值；(5)將剩余細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，2 000 r/min，5 min，離心后直接涂片；(6)將涂片烤干后進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色3 min，沖洗染液后烤干涂片；(7)油鏡下計(jì)數(shù)各類200個(gè)白細(xì)胞，并計(jì)算各類白細(xì)胞所占的百分比，流程見圖1。

圖1 誘導(dǎo)痰細(xì)胞檢查操作流程

3.注意事項(xiàng)

(1)對于霧化時(shí)間已延長但仍不能誘導(dǎo)出痰的患者，建議放棄此次檢查，以免引起患者氣道高反應(yīng)；(2)為確保納入檢查的痰標(biāo)本合格，重量以大于0.5 g為宜，若痰質(zhì)量較好(粘稠)，稍小于0.5 g亦可；(3)痰消化時(shí)間以小于30 min為宜，消化期間不斷搖勻使消化完全；(4)染色時(shí)，將A與B液加入后混勻，時(shí)間夏季適當(dāng)縮短，冬季適當(dāng)延長，延長時(shí)間控制在2 min以內(nèi)；(5)染色液儲存需密封，否則空氣中CO2會影響染液pH值，最終將會影響染色效果。

三、誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查的細(xì)胞形態(tài)

痰中的細(xì)胞形態(tài)跟血液中的細(xì)胞形態(tài)相似，判斷標(biāo)準(zhǔn)也相同，但是痰中細(xì)胞體積個(gè)體差異較大，且形態(tài)結(jié)構(gòu)并無血液中那么清晰，所以辨認(rèn)時(shí)需格外注意。

圖2 誘導(dǎo)痰細(xì)胞鏡下細(xì)胞形態(tài)(A：100×，BCD：1 000×)；注：Eos：嗜酸性粒細(xì)胞；Neu：中性粒細(xì)胞；Lym：淋巴細(xì)胞；Mac：巨噬細(xì)胞

2.嗜酸性粒細(xì)胞：細(xì)胞呈圓形，直徑13～15 μm，大小胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大、均勻的紅色顆粒，由于細(xì)胞漿內(nèi)大量嗜酸性顆粒的覆蓋，常導(dǎo)致細(xì)胞核染色較淺，核結(jié)構(gòu)不清，同時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞亦容易破碎，常分散于細(xì)胞核周圍，見圖2B。

3.中性粒細(xì)胞：中性粒細(xì)胞呈圓形，直徑10～12 μm，胞質(zhì)常染為淡紅色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒較小；細(xì)胞核呈分葉狀，以三葉多見，見圖2C。

4.淋巴細(xì)胞：淋巴細(xì)胞呈圓形，直徑6～9 μm，細(xì)胞質(zhì)量很少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無顆粒；細(xì)胞核染為藍(lán)色，由于胞質(zhì)較少鏡下形似裸核，見圖2D。

5.巨噬細(xì)胞：巨噬細(xì)胞源自于單核細(xì)胞系統(tǒng)，細(xì)胞呈圓形，體積其他相對較大，且體積差異亦較大。細(xì)胞質(zhì)含量豐富，具有較強(qiáng)的吞噬功能，多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量的吞噬顆粒，故細(xì)胞質(zhì)染色較深；細(xì)胞核相對較大，且大小不一，核內(nèi)結(jié)構(gòu)不清，見圖2E。

6.常見疾病誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類圖像

四、誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查的參考值，見圖3

圖3 常見疾病誘導(dǎo)痰檢測(400×)；注：A：正常；B：嗜酸性細(xì)胞性胸膜炎；C：哮喘；D：COPD

目前，該檢查國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的參考值，但國內(nèi)外研究結(jié)果相似，痰中非上皮細(xì)胞主要以中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞為主，其次為淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。在我國不同城市相繼建立了本地區(qū)的正常范圍，我們前期也建立了重慶地區(qū)參考值[3]，結(jié)果見表2。

表2 重慶地區(qū)誘導(dǎo)痰細(xì)胞檢查參考值

五、誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查的應(yīng)用

誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類可評價(jià)機(jī)體嗜酸性細(xì)胞炎癥和中性細(xì)胞炎癥，特別是在肺部疾病的診治中其敏感性和特異性高于血液中細(xì)胞分類，其在呼吸系統(tǒng)常見疾病中的應(yīng)用如下。

1.在支氣管哮喘中的應(yīng)用：目前哮喘的診斷主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、體征，結(jié)合患者肺功能檢查進(jìn)行確診，誘導(dǎo)痰細(xì)胞檢查尚未作為哮喘診斷的常規(guī)項(xiàng)目，但已知多數(shù)支氣管哮喘(哮喘)患者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例增高[4]，且與哮喘癥狀相關(guān)，在我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，哮喘患者中83.7%的患者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例升高[5]，故當(dāng)患者肺功能檢查不能完全配合時(shí)，可參考誘導(dǎo)痰細(xì)胞檢查結(jié)果進(jìn)行輔助診斷。在哮喘患者抗炎治療后其誘導(dǎo)痰中嗜酸粒細(xì)胞比例顯著減少，與氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性成正相關(guān)，且比血清中ECP能更準(zhǔn)確和靈敏地反映哮喘患者的氣道炎癥水平，因此誘導(dǎo)痰細(xì)胞檢查是評價(jià)哮喘氣道炎癥的重要指標(biāo)[6]。研究證實(shí)對于誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞百分比>3%的患者，對激素治療反應(yīng)較好，臨床癥狀會得到很好地控制，肺功能也會很快得到改善[7-8]。因此，誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查可對哮喘患者治療過程中氣道炎癥動態(tài)變化進(jìn)行檢測，幫助判斷治療效果和調(diào)整治療方案，并對進(jìn)行長期優(yōu)化管理和預(yù)后進(jìn)行評估。在我們前期研究還發(fā)現(xiàn)，在一部分哮喘患者經(jīng)吸入激素治療以后，誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞顯著減少，同時(shí)其細(xì)胞表型發(fā)生了變化，這表明誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類既可作為激素治療反應(yīng)性的敏感指標(biāo)，還可為哮喘的機(jī)制研究提供新的方向[9]。

誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類除了可以輔助診斷哮喘和指導(dǎo)治療哮喘外，還可對哮喘進(jìn)行細(xì)胞分型。目前，根據(jù)誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞增高與否，可先將哮喘分為四種炎癥表型：嗜酸性粒細(xì)胞型(單純嗜酸性粒細(xì)胞百分比≥1%)、中性粒細(xì)胞型(中性粒細(xì)胞百分比≥61%)、混合細(xì)胞型(嗜酸性粒細(xì)胞百分比≥1%且中性粒細(xì)胞百分比≥61%)、寡細(xì)胞型(嗜酸性粒細(xì)胞百分比<1%且中性粒細(xì)胞百分比<61%)[10-11]。不同的炎性表型相應(yīng)的治療策略亦有差異，如嗜酸性粒細(xì)胞型多為典型哮喘，對激素治療較敏感；中性粒細(xì)胞型患者常合并呼吸道感染等因素，對激素的治療反應(yīng)較差；混合細(xì)胞型多見于難治性哮喘或哮喘嚴(yán)重發(fā)作者，病情相對較重；寡細(xì)胞型多見于病情輕微的哮喘患者，如間歇狀態(tài)哮喘或哮喘得到良好控制者，因此可以根據(jù)誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類，選擇相應(yīng)的治療方案[12-13]。

2.在COPD中的應(yīng)用：COPD患者誘導(dǎo)痰中以中性粒細(xì)胞性炎癥為主，既往研究表明COPD患者氣道中中性粒細(xì)胞浸潤程度達(dá)到70%以上，且患者氣道阻塞其嚴(yán)重程度與痰中性粒細(xì)胞的百分比成正比[14]。但約20%～40%的COPD患者仍存在嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥，這與COPD患者發(fā)生急性加重嚴(yán)重程度、頻率、病死率密切相關(guān)，所以誘導(dǎo)痰也是判斷COPD氣道炎癥類型的重要工具[15-19]。此外，誘導(dǎo)痰細(xì)胞計(jì)數(shù)在COPD治療上也有一定幫助，研究顯示COPD患者痰中浸潤Eos，對糖皮質(zhì)激素有較好的反應(yīng)性，提示可用激素治療改善癥狀[20]；若痰中主要浸潤中性粒細(xì)胞，提示患者有感染，可采用抗菌治療[21]。

3.在慢性咳嗽中的應(yīng)用：在我國慢性咳嗽主要分為五類：上氣道咳嗽綜合征(up-airway cough syndrome, UACS)、咳嗽變異性哮喘(cough variance asthma, CVA)、嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎(eosinophil bronchitis, EB)、胃食管反流性咳嗽(gastroesophageal reflux cough, GERC)、變應(yīng)性咳嗽(atopic cough, AC)，誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查在慢性咳嗽的診斷和治療中均有重要的作用[22]。在2015版《咳嗽的診斷與治療指南》中，已將該檢查已作為慢性咳嗽的常規(guī)檢查方法。CVA時(shí)，嗜酸粒細(xì)胞浸潤為其關(guān)鍵特征之一，較FeNO和血清ECP能更靈敏、直接、客觀地反映氣道炎癥狀態(tài)[23]。文獻(xiàn)報(bào)道，CVA中近90%的患者痰中嗜酸性粒細(xì)胞顯著的增高，這與我們既往的研究結(jié)果相一致[5,24-25]，對CVA具有一定輔助診斷作用。在CVA的治療上，可依據(jù)誘導(dǎo)痰檢查判斷CVA患者是否應(yīng)該接受激素治療、治療劑量如何，為CVA的早期治療提供的治療方向。在EB時(shí)，由于缺乏特征性臨床改變，氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥為其主要特征，故痰中嗜酸性粒細(xì)胞增高為其主要診斷依據(jù)，即當(dāng)排除其他慢性咳嗽，若痰中嗜酸性粒細(xì)胞百分比>2.5%，可診斷為EB[26]。

4.其他疾病：除了上述常見的氣道炎癥性疾病以外，誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類在其他肺部疾病中，也有指導(dǎo)意義。在慢性阻塞性肺疾病-支氣管哮喘重疊綜合征(ACOS)中，患者氣道炎癥主要由中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)，痰中性粒細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞比例均明顯增高，研究表明誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類計(jì)數(shù)對其診斷的特異性達(dá)80%，故誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查可輔助ACOS的診斷[27-28]。在間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)中，支氣管肺泡灌液(bronchoalveolar lavage, BALF)在ILD臨床診治中有較廣泛的應(yīng)用，但由于其具有極大的創(chuàng)傷性一定程度上限制了其應(yīng)用，而誘導(dǎo)痰與BALF具有較好的相關(guān)性，因此，誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類也可為ILD的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷、活動性評估以及預(yù)后判斷等方面提供重要價(jià)值[29]。變應(yīng)性鼻炎時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞通過釋放炎癥介質(zhì)抑制自身凋亡，同時(shí)活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化和移行，參與變應(yīng)性鼻炎氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，可見，誘導(dǎo)痰細(xì)胞分類檢查也可用來評價(jià)變應(yīng)性鼻炎的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)情況[30]。近來研究顯示，在社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞可參與機(jī)體對細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)，CAP患者肺炎鏈球菌水平與痰中嗜酸性粒細(xì)胞百分比呈明顯的負(fù)相關(guān)，認(rèn)為痰中嗜酸性粒細(xì)胞在呼吸道感染高危人群中具有重要的預(yù)測價(jià)值[31-32]。