miR-26a靶向ADAM10對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖及遷移的影響

于守杰 張振春 厲彥山 張麗麗

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜浸潤性增生、關節軟骨和骨質破壞為主要病理改變的慢性自身免疫性疾病［1］。成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）在RA 中起重要作用，FLS 的異常增殖造成的滑膜增生可造成關節畸形，進而加重RA，嚴重危害患者身體健康［2］。因此，通過抑制FLS 的異常增殖、遷移從而抑制滑膜增生是改善關節炎的重要途徑。研究表明miRNA 可通過參與調控FLS 的增殖、遷移影響RA進展［3］。李廣科等［4］研究發現RA 患者關節滑液及外周血中miR-26a 異常高表達，其與病情活動程度及炎癥程度密切相關，miR-26a 的異常表達可能與病變滑膜組織及浸潤細胞的分泌有關。但miR-26a 影響RA 的具體機制尚不清楚。解整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）屬于ADAM 家族，是一種跨膜蛋白，研究報道沉默ADAM10 可促進類風濕關節炎滑膜成纖維細胞凋亡，減少炎性因子的分泌［5］。抑制ADAM10 可抑制類風濕關節炎中成纖維樣滑膜細胞的遷移和侵襲［6］。因此，本實驗旨在研究miR-26a 對RA-FLS 增殖、遷移的影響及機制是否與ADAM10有關。

1 材料與方法

1.1 材料

類風濕性關節炎成纖維滑膜細胞系MH7A 購自美國ATCC；胎牛血清、DMEM 培養基購自武漢益普生物科技有限公司；脂多糖（LPS）購自上海廣銳生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；細胞計數試劑盒8（CCK-8）購自杭州仟諾生物科技有限公司；RIPA 蛋白裂解液、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；ADAM10、Ki-67、N-cadherin、E-cadherin、GAPDH 抗體及山羊抗兔IgG-HRP 購自上海恒斐生物科技有限公司；Transwell 小室購自上海研卉生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 細胞處理與分組

MH7A 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養基在37℃恒溫培養箱培養，取對數生長期細胞，用1 μg/mL 的LPS 處理MH7A 記為LPS 組，正常培養的細胞作為對照（Con）組；將miR-NC、miR-26a、pcDNA3.1、pcDNA3.1-ADAM10 分別轉染至MH7A中，再用1 μg/mL 的LPS 處理，記為LPS+miR-NC組、LPS+miR-26a 組、LPS+pcDNA3.1 組、LPS+pcDNA3.1-ADAM10 組。將miR-26a 分別與pcDNA3.1、pcDNA3.1-ADAM10 共轉染至MH7A 中，再用1 μg/mL 的LPS 處理，記為LPS+miR-26a+pcDNA3.1 組、LPS+miR-26a+pcDNA3.1-ADAM10 組。

1.3 CCK-8 檢測細胞增殖活性

將細胞以1×104個/孔接種于96 孔板，培養24 h時每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，孵育2 h，酶標儀檢測490 nm 波長處的吸光度值（OD）。細胞增殖活性（%）=實驗組OD 值/空白對照組OD 值×100%。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數

調整細胞濃度為1×104個/mL，以每孔100 個接種于六孔板中，每組設3 個復孔，培養2 周出現肉眼可見克隆時終止培養，PBS 清洗2 遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數＞50 個細胞的集落。

1.5 Transwell 檢測細胞遷移

將600 μL 培養液和100 μL 細胞懸液加入Transwell 小室的下室和上室，放入細胞培養箱中培養24 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 溶液沖洗2 次，室溫下加入0.1%結晶紫染色30 min。沖洗2次，用無菌棉球輕輕擦去上室表面細胞，顯微鏡下隨機觀察5 個視野，計算細胞遷移數目。

1.6 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-26a 和ADAM10 的靶向關系

構建含miR-26a結合位點的ADAM10野生型和突變型載體熒光素酶表達載體，將其分別與miR-NC、miR-26a 共轉染至細胞MH7A 中，轉染48 h 后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，計量資料用（）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖的影響

與對照組相比，LPS 組miR-26a 表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高，克隆形成數顯著升高，Ki67 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS+miR-NC組相比，LPS+miR-26a 組miR-26a 表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，克隆形成數顯著降低，Ki67 表達水平顯著降低（圖1，表1）。

表1 miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖的影響（±s）Table 1 Effects of miR-26a on the proliferation of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

表1 miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖的影響（±s）Table 1 Effects of miR-26a on the proliferation of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

注：與Con 相比，aP＜0.05；與LPS 相比，bP＜0.05；與LPS+miR-NC 相比，cP＜0.05。

分組Con 組LPS 組LPS+miR-NC 組LPS+miR-26a 組F 值P 值n9999 miR-26a 0.95±0.05 0.25±0.02a 0.26±0.02 0.82±0.04bc 992.816 0.000 OD 值0.43±0.03 1.21±0.08a 1.20±0.08 0.61±0.04bc 380.765 0.000克隆形成數50.04±5.54 122.58±9.73a 123.07±8.07 66.60±6.21bc 225.177 0.000 Ki67 0.20±0.02 0.76±0.05a 0.76±0.04 0.34±0.03bc 555.333 0.000

2.2 miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞遷移的影響

與對照組相比，LPS 組遷移細胞數顯著升高，N-cadherin 表達水平顯著升高，E-cadherin 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與LPS+miR-NC 組相比，LPS+miR-26a 組遷移細胞數顯著降低，N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin 表達水平顯著降低（圖2，表2）。

2.3 miR-26a 靶向ADAM10

TargetScan 數據庫預測顯示miR-26a 與AD-AM10 存在結合位點（圖3）。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC 組相比，miR-26a 組中轉染ADAM10 野生型表達載體的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而轉染ADAM10 突變型表達載體的細胞熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。與miR-NC 組相比，miR-26a 組ADAM10 表達水平顯著降低（P＜0.05）（表4）。

表2 miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞遷移的影響（±s）Table 2 Effect of miR-26a on the migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

表2 miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞遷移的影響（±s）Table 2 Effect of miR-26a on the migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

注：與Con 相比，aP＜0.05；與LPS 相比，bP＜0.05；與LPS+miR-NC 相比，cP＜0.05。

分組Con 組LPS 組LPS+miR-NC 組LPS+miR-26a 組F 值P 值n9999遷移細胞數51.64±4.86 129.27±6.73a 129.03±6.77 68.22±5.50bc 407.921 0.000 N-cadherin 0.29±0.03 0.84±0.06a 0.85±0.06 0.37±0.03bc 357.967 0.000 E-cadherin 0.71±0.04 0.17±0.01a 0.18±0.01 0.54±0.03bc 964.444 0.000

表3 雙熒光素酶實驗（±s）Table 3 Double luciferase experiments（±s）

表3 雙熒光素酶實驗（±s）Table 3 Double luciferase experiments（±s）

分組miR-NC 組miR-26a 組t 值P 值n99 WT-ADAM10 1.00±0.06 0.16±0.01 41.429 0.000 MUT-ADAM10 0.99±0.05 0.96±0.06 1.152 0.266

表4 miR-26a 調控ADAM10 的表達（±s）Table 4 miR-26a regulates ADAM10 expression（±s）

表4 miR-26a 調控ADAM10 的表達（±s）Table 4 miR-26a regulates ADAM10 expression（±s）

分組miR-NC miR-26a t 值P 值n99 ADAM10 0.58±0.03 0.21±0.01 35.101 0.000

2.4 ADAM10 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移的影響

與LPS+pcDNA3.1 組相比，LPS+pcDNA3.1-ADAM10 組ADAM10 表達水平顯著升高，細胞活性顯著升高，克隆形成數及遷移細胞數顯著升高，Ki67、N-cadherin 表達水平顯著升高，E-cadherin 表達水平顯著降低（P＜0.05）（圖4，表5）。

2.5 ADAM10 能逆轉miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移的影響

與LPS+miR-26a+pcDNA3.1 組相比，LPS+miR-26a+pcDNA3.1-ADAM10 組細胞活性顯著升高，克隆形成數及遷移細胞數顯著升高，Ki67、N-cadherin 表達水平顯著升高，E-cadherin 表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表6、圖5。

表5 ADAM10 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移的影響（±s）Table 5 Effects of ADAM10 on the proliferation and migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

表5 ADAM10 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移的影響（±s）Table 5 Effects of ADAM10 on the proliferation and migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

分組LPS+miR 26a+pcDNA3.1 LPS+miR 26a+pcDNA3.1 ADAM10 t 值P 值n 9 9 OD 值0.61±0.04 1.05±0.11 11.278 0.000克隆形成數66.58±5.79 108.24±7.35 13.357 0.000遷移細胞數68.23±5.55 114.15±7.32 14.997 0.000 Ki67 0.33±0.03 0.57±0.04 14.400 0.000 N cadherin 0.37±0.04 0.68±0.05 14.524 0.000 E cadherin 0.54±0.03 0.27±0.02 22.465 0.000

表6 ADAM10 能逆轉miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移的影響（±s）Table 6 ADAM10 can reverse the effect of miR-26a on the proliferation and migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

表6 ADAM10 能逆轉miR-26a 對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移的影響（±s）Table 6 ADAM10 can reverse the effect of miR-26a on the proliferation and migration of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（±s）

分組LPS+pcDNA3.1 組LPS+pcDNA3.1-ADAM10 組t 值P 值n 9 9 ADAM10 0.54±0.04 1.18±0.12a 15.179 0.000 OD 值1.22±0.07 1.55±0.13a 6.705 0.000克隆形成數122.60±9.71 161.73±10.04a 8.405 0.000遷移細胞數129.28±6.81 172.72±7.03a 13.315 0.000 Ki67 0.76±0.05 1.15±0.11a 9.683 0.000 N-cadherin 0.83±0.06 1.24±0.12a 9.168 0.000 E-cadherin 0.18±0.01 0.06±0.01a 25.456 0.000

3 討論

RA 是自身免疫性疾病，其主要的病理特點是滑膜增生并侵蝕關節軟骨和骨質，最終導致關節破壞畸形；FLS 在RA 的發生發展中起重要作用，尋找與FLS 相關的RA 治療靶點，通過阻斷滑膜增生和骨質侵蝕來阻斷或延緩RA 的進展對治療RA 具有重要的理論與現實意義［7］。且miR-26a 可改善大鼠的關節炎［8］。為研究miR-26a 是否影響FLS進而影響RA，本實驗用LPS 處理MH7A 細胞模擬RA 體內環境，結果顯示LPS 可誘導FLS 增殖和遷移，表明類風濕關節炎滑膜成纖維細胞模型建立成功。且本實驗結果顯示miR-26a 表達水平顯著降低，與前人研究結果相符。本實驗結果提示miR-26a 可能是與FLS 相關的RA 靶點。

已有研究報道RA 血清中ADAM10 高表達，ADAM10 可介導類風濕關節炎中的單核細胞遷移和粘附［9］。ADAM10 是托珠單抗治療RA 療效的預測指標［10］。表明ADAM10 不僅影響RA 發生發展，還可作為其預測指標。而本實驗結果顯示，過表達ADAM10 可促進類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、遷移。表明ADAM10 可參與調控RA-FLS 的增殖、遷移。此外，還有研究報道miR-152 可通過靶向ADAM10 抑制RA-FLS 增殖并誘導凋亡［11］。為研究miR-26a 影響RA-FLS 增殖、遷移的機制是否與ADAM10 有關，本實驗通過TargetScan 數據庫預測miR-26a 可能的靶mRNA，結果顯示miR-26a 與ADAM10 的3′UTR 存在結合位點，雙熒光素酶報告實驗表明miR-26a 靶向負調控ADAM10 表達。本實驗同時過表達ADAM10 和miR-26a 后，結果顯示過表達ADAM10 逆轉了miR-26a 對RA-FLS 增殖、遷移的抑制作用。提示，miR-26a 可能通過調控ADAM10 影響RA-FLS 增殖、遷移。

綜上所述，過表達miR-26a 可能通過靶向下調ADAM10 抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞的增殖、遷移。為通過靶向抑制FLS 的異常增殖、遷移從而抑制滑膜增生是改善類風濕關節炎提供了新靶點和理論依據。