復發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清25（OH）D水平與炎癥因子、自身免疫抗體及T淋巴細胞亞群分布的相關性分析

郝月蘭 劉輝 呂明云 滕懷香

復發(fā)性流產(chǎn)（Recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)發(fā)生2 次或2 次以上的自然流產(chǎn)，目前認為其病因主要包括染色體異常、母體生殖道異常、母體內(nèi)分泌異常等［1-2］，但部分RSA 孕婦上述各項檢查均正常、具體病因不明，探索不明病因RSA 孕婦的發(fā)病機制是當下婦產(chǎn)科研究的重點。近年研究［3-4］發(fā)現(xiàn)維生素D 在胚胎種植的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，且足量的維生素D 可提高體外受精成功率。關于維生素D 在RSA 發(fā)生中扮演的角色尚未有明確定論，25-羥維生素D［25（OH）D］是維生素D 的活性成分，文中探討RSA孕婦血清中25（OH）D 的表達情況，進一步探討25（OH）D 與機體免疫炎癥的內(nèi)在聯(lián)系，旨在明確不明病因RSA 孕婦的可能致病因素并為后續(xù)臨床干預提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年12月間在本院進行清宮的復發(fā)性流產(chǎn)孕婦40 例作為RSA 組，年齡22～35（28.94±5.23）周歲，體質指數(shù)（23.71±3.04）kg/m2，月經(jīng)周期（28.49±4.51）d；選取同期在本院進行人工流產(chǎn)的健康女性40 例作為對照組，年齡21～38（28.67±5.51）周歲，體質指數(shù)（23.59±3.21）kg/m2，月經(jīng)周期（28.52±4.88）d。均為無疾病狀況下本人要求進行流產(chǎn)術、本人簽署知情同意書。兩組孕婦在年齡、體質指數(shù)、月經(jīng)周期的分布，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。研究計劃得到本院倫理委員會批準。

納入標準：①符合中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科學分會產(chǎn)科學組制定的《復發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識》［5］中對RSA 的定義；②既往無RSA 針對性治療史；③患者年齡20～50 周歲；④夫妻雙方染色體核型均正常；⑤月經(jīng)周期規(guī)律，入組前3 個月內(nèi)無維生素D 服用史；⑥本人簽署知情同意書。排除標準：①合并盆腔生殖道器質性疾病；②宮頸分泌物檢測出生殖道感染；③合并血液高凝狀態(tài)；④男方精液異常。

1.2 方法

1.2.1 血清25-羥維生素D、炎癥因子水平檢測

清宮術實施前24 h，留取兩組孕婦的空腹外周靜脈血標本約5.0 mL，室溫靜置24 h 后留取上層血清。應用USA BIO-RAD 680 型全自動酶標儀、酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（上海西唐公司）檢測血清中25（OH）D 的水平，按照20 ng/mL 作為閾值將復發(fā)性流產(chǎn)組孕婦分為高25（OH）D 組（16 例）、低25（OH）D 組（24 例）。采用酶聯(lián)免疫吸附法（上海西唐公司）檢測復發(fā)性流產(chǎn)孕婦血清中炎癥因子白介素-6（IL-6）。

1.2.2 自身免疫抗體水平檢測

RAS 孕婦的空腹外周靜脈血標本同1.2，采用間接免疫熒光法試劑盒（北京生東科技公司）檢測其中抗心磷脂抗體（ACA）、抗子宮內(nèi)膜抗體（AEMAb）、抗HCG 抗體（AHCGAb）、抗核抗體（ANA）的陽性表達情況，采用化學發(fā)光免疫分析法（貝克曼庫爾特公司）檢測甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）的陽性表達情況。

1.2.3 T 淋巴細胞亞群分布情況檢測

RAS 的空腹外周靜脈血標本同1.2，采用USA BD FACSCanto II 流式細胞儀及相應試劑（BD 公司）檢測CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD56+T 淋巴細胞的分布情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用軟件SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進行處理，兩組間計數(shù)資料以n（%）表示、比較采用χ2檢驗；計量資料以（）表示，獨立樣本比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清25（OH）D 水平比較

RSA 組孕婦血清中25（OH）D 的水平為（18.39±2.76）ng/mL，正常組孕婦血清中25（OH）D的水平為（34.72±5.19）ng/mL。RSA 組孕婦血清中25（OH）D 的水平顯著低于對照組孕婦，差異有統(tǒng)計學意義（t=25.406，P=0.000）。

2.2 不同25（OH）D 水平RSA 患者炎癥因子、T 淋巴細胞亞群比較

低25（OH）D 組孕婦血清中IL-6 水平低于高25（OH）D 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低25（OH）D 組孕婦外周血中CD3+、CD3+CD4+T 淋巴細胞的分布比例高于高25（OH）D 組孕婦，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組間CD3+CD8+T 淋巴細胞分布比例的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同25（OH）D 水平RSA 患者炎癥因子、T 淋巴細胞亞群比較（±s）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines and T lymphocyte subsets between RSA patients with different 25（OH）d levels（±s）

表1 不同25（OH）D 水平RSA 患者炎癥因子、T 淋巴細胞亞群比較（±s）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines and T lymphocyte subsets between RSA patients with different 25（OH）d levels（±s）

組別低25（OH）D 組高25（OH）D 組t 值P 值n 24 16 IL-6（pg/mL）11.30±1.67 15.62±2.39 9.371 0.000 CD3+（%）73.48±3.29 68.36±3.40 6.844 0.000 CD3+CD4+（%）45.83±5.19 36.20±4.56 8.816 0.000 CD3+CD8+（%）25.81±4.52 25.76±4.19 0.051 0.480

2.3 不同25（OH）D 水平RSA 患者自身免疫抗體比較

低25（OH）D 組孕婦外周血中ACA、AEMAb、AHCGAb、ANA、TPOAb 的陽性率高于高25（OH）D 組孕婦，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同25（OH）D 水平RSA 患者外周血自身免疫抗體陽性率的比較［n（%）］Table 2 Comparison of autoantibody positive rates in peripheral blood between RSA patients with different 25（OH）d levels［n（%）］

2.4 相關性分析

Pearson 檢驗發(fā)現(xiàn)，RSA 孕婦血清中25（OH）D的水平與IL-6 的水平呈正相關（P＜0.05）；與ACA、AEMAb、AHCGAb、ANA、TPOAbCD3+、CD3+CD4+T 淋巴細胞的分布比例的水平呈負相關差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

維生素D 缺乏是一個世界性問題，且在妊娠期女性中也普遍存在。維生素D 的基礎功能是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，最新研究認為其也參與免疫、生殖等生理過程［6-7］。Li N［8］的研究發(fā)現(xiàn)，RSA 婦女的母-胎界面維生素D 及其受體表達減少，推測維生素D 缺乏是導致RSA 發(fā)生的重要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)RSA 組孕婦血清中25（OH）D 的水平較正常流產(chǎn)孕婦有顯著降低，說明異常低水平的25（OH）D 與RSA 的發(fā)生有關，低水平的25（OH）D 可能通過影響炎癥反應及免疫應答來參與RSA 的發(fā)病。基于此，本研究將進一步從炎癥反應、自身免疫抗體、T 淋巴細胞亞群三方面展開闡述。

母胎界面中免疫耐受的建立是保證胎兒生長發(fā)育的基礎，分布在母胎界面的Th1/Th2 細胞對母胎免疫耐受的建立至關重要。Th1 細胞分泌的細胞因子IL-2、TNF-α 等可調(diào)控細胞增殖分化并能量代謝、為胎兒生長發(fā)育提供良好的環(huán)境，但過高的Th1 細胞因子水平會引起免疫排斥、增加胎盤植入難度［9］。Th2 細胞分泌IL-6 等細胞因子，可刺激B 細胞活性并降低排斥作用，增加母胎之間的適應性及相容性［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，低25（OH）D 組孕婦血清中IL-6 的水平較低且RSA 孕婦血清25（OH）D 水平與IL-6 的水平呈正相關，結合IL-6 在免疫耐受維持中的作用分析，25（OH）D 表達減少可能抑制Th2 細胞因子IL-6 的釋放，進而影響妊娠的維持。

表3 RSA 孕婦25（OH）D 與炎癥因子、自身免疫抗體及T 淋巴細胞亞群分布的相關性Table 3 Correlation between 25（OH）D and inflammation cytokine，autoimmune antibodies and T lymphocyte subsets distribution in RSA pregnant women

RSA 孕婦母胎界面免疫應答的異常多伴有自身免疫功能異常。朱曉芳［11］、嚴兆華［12］的研究均證實RSA 的出現(xiàn)與自身抗體的異常高表達相關。ACA、ANA、TPOAb 屬于組織特異性抗體，可能通過激活全身免疫系統(tǒng)引起母胎界面免疫調(diào)節(jié)異常；AEMAb、AHCGAb 屬于生殖免疫抗體，有研究［13］發(fā)現(xiàn)孕12 周以前的早期流產(chǎn)孕婦上述自身免疫抗體的陽性率顯著高于晚期流產(chǎn)者。此外，T 細胞亞群異常是RSA 患者自身免疫應答異常的另一特征，Ren J［14］的證實人類蛻膜組織中存在大量淋巴細胞，當CD4+T 淋巴細胞被異常激活時可能對滋養(yǎng)細胞產(chǎn)生潛在毒性。

綜上所述，可得出結論：RSA 孕婦存在25（OH）D 異常低水平，且與機體免疫炎癥反應紊亂程度密切相關，低水平的25（OH）D 可能由此參與RSA 的發(fā)生發(fā)展。關于25（OH）D 表達改變對胚胎細胞各種生物學行為的直接影響，有待后續(xù)基礎研究進一步明確。