非小細胞肺癌患者ALK、ROS1及BRAF-V600E基因突變與臨床特征的相關性

李華芳

肺癌是世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，同時還是男性癌癥死因中的首位［1］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌的85%，大約有三分之二的NSCLC患者在確診時已無根治性手術的機會［2］。由于他們的治療方案有限，預后差，生存率低［3］。近年來，以分子靶向治療為核心的個體化治療逐漸成為NSCLC 治療的研究熱點。以EGFR-TKI 為代表的小分子酪氨酸蛋白激酶（PTK）抑制劑的應用，極大程度改善了NSCLC 患者的預后。在美國國家綜合癌癥網絡（NCCN）“非小細胞肺癌精準治療（2019V1）”中，非小細胞肺癌指南專家組強烈建議進行廣泛的分子檢測，其目的在于識別罕見的驅動突變；因此，本文探討NSCLC 中間變性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphomakinase，ALK）和原癌基因蛋白酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）基因融合及鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）V600E 基因突變情況，分析其與臨床病理特征（性別、年齡、吸煙史、組織學分型）的相關性，為促進NSCLC 靶向治療的進展，改善患者的預后提供一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集本院2015年9月1日至2019年9月1日期間NSCLC 的病例。排除經免疫組化標記仍未能明確組織學類型的或活檢標本中腫瘤細胞數量較少、難以保證結果準確性的病例后，最終有1 042 例患者的石蠟包埋組織納入研究。其中男性550 例，女性492 例；年齡≥60 歲560 例，年齡＜60 歲482 例；其中貼壁為主型腺癌492 例，實性腺癌為主型252 例，腺泡型腺癌為主型200 例，粘液性腺癌47 例，腺泡型伴微乳頭型腺癌51 例。所有病理組織標本均應用10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，蠟塊資料保存完整。所有病例均進行了ALK及ROS1融合基因的檢測，其中選取2018年以后的114 例進行了BRAF-V600E 的檢測。

1.2 方法

采用人類ALK基因融合（生產批號11219041601X 11219032101X 11220010201X）和人類ROS1基因融合聯合檢測試劑盒（生產批號11219073102X 11219061202X），人 類BRAF基因V600E 突變檢測試劑盒（生產批號11219090401Z 11219090201Z），均購自廈門艾德生物醫藥科技技術有限公司。取10 片5 μm 厚度的蠟卷脫蠟后加入蛋白酶K 液及Buffer RTL 進行組織裂解，按核酸提取試劑說明書操作方法及步驟進行RNA 及DNA 的提取。并通過ARMS-PCR 方法進行ALK、ROS1和BRAF-V600E 基因的檢測，每一批次實驗均設陰、陽性對照，所用儀器為美國IBM7500 實時熒光定量PCR，具體操作程序參考說明書，數據使用其配套版軟件進行分析。

1.3 統計學分析

運用計算機軟件SPSS 22.0 進行統計分析，計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALK 基因檢測結果及其與臨床病理特征的關系

ALK 基因融合檢測結果顯示年齡≥60 歲的患者ALK基因融合陽性率低于年齡＜60 歲患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；而年齡＜51 歲NSCLC患者的ALK重排的概率低于年齡＜41 歲患者中ALK 重排概率；男女性在性別及是否吸煙及組織學亞型之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 ROS1基因檢測結果及其與臨床病理特征的關系

ROS1基因融合突變在性別及年齡上的比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；而與是否吸煙無相關性，差異無統計學意義（P＞0.05）。在組織學分型中更常見于腺泡型腺癌和微乳頭狀腺癌。見表2。

2.3 BRAF-V600E 基因檢測結果及其與臨床病理特征的關系

BRAF-V600E 檢測結果顯示年齡≥60 歲患者的BRAF-V600E 突變陽性率低于年齡＜60 歲陽性率，BRAF-V600E 基因突變與性別、年齡及有無吸煙史無相關性，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

據國家癌癥中心2019年公布的全國癌癥統計數據顯示，肺癌的發病率和死亡率仍然居所有惡性腫瘤之首［4］。近年來，隨著分子醫學的進展和靶向藥物的不斷研發，腫瘤的治療已進入到“個體化”醫療時代。NSCLC 研究熱點更偏向對腫瘤攜帶的復雜基因突變進行系統的分子分型。準確檢測EGFR、ALK、ROS1、BRAF等肺癌驅動基因的存在狀態，可為NSCLC 患者的靶向用藥治療提供必要依據。

表1 ALK 基因突變與臨床特征的相關性［n（%）］Table 1 Correlation between mutations of ALK gene and clinical features［n（%）］

表2 ROS1 基因突變與臨床特征的相關性［n（%）］Table 2 Correlation between mutations of ROS1 gene and clinical features［n（%）］

表3 BRAF-V600E 基因突變與臨床特征的相關性Table 3 Correlation between mutations of BRAF-V600E and clinical features

ALK基因定位于染色體2p23 帶，其編碼的ALK是胰島素受體家族中成員，正常表達于神經系統。在NSCLC 患者中ALK基因斷裂后主要和活化的EML4gene 融合，通過PIK3/AKT、MAPK/JAK/STAT3 等多條信號傳導通路參與抑制細胞凋亡，促進細胞增殖。

國內楊衿記［5］等綜合了全球17 個實驗結果得出，在未經選擇的NSCLC 患者中，EML4-ALK基因融合的發生率為0.4%～11.7%。東方人的陽性率為4.1%。在年輕NSCLC 患者中，發生ALK基因融合的概率高，在年齡＜51 歲的患者中，發生ALK融合的概率高達18.5%［6］。研究結果與上述報道一致［7］。有文獻報道ALK基因融合情況多見于男性肺腺癌患者。在不吸煙或少吸煙的相對年輕的患者中陽性檢出率較高［8］。而也有報道吸煙不是ALK融合基因的顯著影響因素［7］。據文獻報道ALK基因融合患者病理組織學類型常見于腺泡型腺癌、實性腺癌、粘液癌及印戒細胞癌，常見于年輕的肺腺癌患者，發現時常為晚期［9］。

有研究表明ALK可能是NSCLC 患者的獨立預后因素［10］。臨床試驗顯示克唑替尼對于ALK陽性的晚期NSCLC 患者，療效優于傳統化療，二線單藥治療患者有效率達到65.3%，中位無進展生存期（PFS）為7.7 個月［9］。回顧性研究顯示，克唑替尼后續治療患者中位PFS 達17.4 個月，中位總生存期達49.4 個月［9］。本組有隨訪資料的ALK患陽性患者15 人接受克唑替尼治療后，13 人相關癥狀明顯得到改善，如咳嗽、呼吸困難減輕，胸水逐漸減少，轉移灶消失，原發腫瘤病灶明顯縮小；整體生活質量得到改善。但由于隨訪病例少且隨訪時間短，尚需繼續跟蹤隨訪以獲取更多的數據。

ROS1基因重排代表一類新的獨特的NSCLC分子亞型［11］，有文獻報道ROS1融合基因在NSCLC 中的陽性率為1.0%～3.4%［12］，ROS1基因重排與ALK基因融合的NSCLC 患者在臨床特征上有明顯吻合，而且亞洲患者占多數。CAI W等［13］等發現在中國人群中ROS1重排陰性的患者相比陽性患者有一個相對好的預后。但是屬于小樣本范圍內的比較，且未能在兩組患者間發現吸煙史、性別及年齡上的差異。有研究認為，陽性多見于年輕、不吸煙、組織學低分化的肺腺癌患者［14］，組織成分中腺泡狀和/或乳頭狀成分顯著。

BRAF是一種編碼絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶，屬于RAF家族。RAF是RAS-RAF-MEK-ERK 信號轉導通路中的重要成員，它與ERFR、ALK等均屬于PTK家族，在腫瘤細胞增殖、分化和凋亡等方面發揮重要作用［15］。BRAF最常見的突變位點為BRAF-V600E，其突變將導致轉導通路改變和激酶活性增加，進而導致腫瘤的產生及轉移［16］。Karbel HAE［17］在9.3%的NSCLC 患者中發現了BRAFV600E 突變，Willenbacher E［18］等的研究顯示，BRAF-V600E 突變更常見于吸煙者。既往研究表明BRAF-V600E 突變預后差［19］。有研究顯示BRAF-V600E 突變的高度特異性與EGFR 酪氨酸激酶抑制劑的反應呈負相關，在組織學上往往伴有更具有侵襲性的組織學類型出現，如微乳頭狀癌成分［17］。研究結果顯示，有3 例伴有不同數量的微乳頭狀癌成分，其中兩例以微乳頭狀癌成分為主，由于缺乏相關的隨訪資料，無法證實其預后與野生型的差異。BRAF-V600E 突變一般預示著腫瘤更具有侵襲性，與不良預后相關［20］。因此，BRAF-V600E 可能成為NSCLC 新的治療靶點。但對于肺腺癌BRAF基因突變的研究僅限于V600E，其他BRAF基因突變位點目前尚未能知，并且BRAF基因突變對NSCLC 治療預測和預后的機制與作用，都值得進一步探討。

綜上所述，在靶向治療前，多基因聯合檢測具有重要意義，一方面與以往的單獨檢測比較節約了組織并且提高了檢測效率，另一面可以為NSCLC 的個體化靶向治療提供更多的臨床依據。