EVI1基因對胃癌細胞生長及侵襲的機制研究

柳子川

（廣州醫科大附屬腫瘤醫院腫瘤內二科 廣東 廣州 510095）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。胃癌的發病隱匿，初始臨床癥狀不顯著。很多患者確診的時候已經是疾病的中、晚期，失去了治療的最佳機會。因此，發掘可能導致胃癌發生及進展的分子標記物具有重要的意義。

胃癌的發病原因比較多，比如有飲食習慣，環境因素，幽門螺桿菌感染及癌基因的異常激活等因素。其中，癌基因的異常激活是導致胃癌發生及進展一個很重要的原因。這些癌基因的異常激活通常可以導致胃粘膜上皮細胞發生變異，出現異常的增殖，進而出現癌變[1]。檢測異常表達的癌基因可以較早期檢測出胃癌的病變，對胃癌的防治具有重要的臨床意義。

1.材料及實驗方法

1.1 實驗材料

PRMI-1640培養基，胎牛血清，0.25%胰酶消化液購買自hyclone公司。MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），溴酚藍，多聚甲醛購買自sigma公司。Lipofectamine? RNAiMAX購自invitrogen公司。小分子干擾RNA片段購自廣州銳博公司。transwell小室購自corning公司。EVI1，cyclind1，MMP9和GAPDH內參一抗購自santa cruz公司。鼠抗人二抗購自中杉金橋公司。超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天公司。

1.2 細胞培養

胃癌細胞SGC-7901培養在含10%胎牛血清的PRMI-1640培養基之中。細胞在含5% CO2,37℃的細胞培養箱中培養。

1.3 細胞轉染

將4×105個處于對數生長期的SGC-7901細胞均勻鋪在6孔板中。24小時細胞貼壁后，將Lipofectamine? RNAiMAX和小分子干擾RNA均勻混合，在室溫下面放置20分鐘。之后將上述混合物加入6孔板中轉染SGC-7901細胞。EVI1干擾RNA轉染的細胞稱為si- EVI1，和陰性對照轉染的細胞稱為si-ctrl。

1.4 MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）實驗

將細胞鋪于96孔板，每個孔細胞密度為6×103/孔,分別于第1d、2d、3d、4d、5d和6d不同時間點，每個孔中加入20 μl初始濃度為5mg/ml的MTT溶液。之后在正常細胞培養環境中再孵育4個小時，棄掉培養液以及MTT。每個孔加入150μl 二甲基亞砜(DMSO)終止反應。細胞活力的測定：采用酶標儀在490nm 處讀取每孔的吸光度值，最后制作細胞增殖曲線。

1.5 平板克隆實驗

將細胞鋪于6孔板中，每4天換培養液1次。共培養2周之后，棄掉培養液。然后使用PBS沖洗干凈細胞，使用4%多聚甲醛固定細胞，蘇木素染色，顯微鏡下觀察細胞形成集落的大小。

1.6 細胞周期實驗

選取處于對數生長期的細胞，用預冷的PBS洗滌細胞。然后把細胞用PBS 溶液重懸，加入70%乙醇溶 液在4℃固定過夜。用PI對細胞進行染色，然后使用流式細胞儀對細胞周期進行分析。

1.7 RT-PCR實驗

使用Trizol提取細胞或者組織中的RNA，然后使用HiScript Ⅱ Q-RT SuperMix試劑盒對RNA進行逆轉錄。

1.8.Transwell實驗

把細胞使用無血清培養基懸浮，鋪于transwell小室里面。將transwell小室放在12孔板上方，12孔板里面添加含10%胎牛血清的培養基作為誘導劑。36個小時之后，取出transwell小室，將未遷徙的細胞用棉簽搽掉。使用4%多聚甲醛固定細胞，蘇木素染色。顯微鏡下面觀察細胞數目。

2.結果

2.1 EVI1影響胃癌細胞的生長能力

我們首先使用小分子干擾RNA（si-RNA）敲除胃癌細胞SGC-7901中EVI1基因的表達（圖1A）。我們把細胞分為對照組（si-ctrl）和實驗組（si-EVI1）。MTT實驗發現：與對照組相比，實驗組細胞生長的速度明顯減慢（圖1B）。平板克隆實驗發現：實驗組的細胞形成克隆的能力較對照組顯著減弱（圖1C）。我們檢測了細胞周期的變化情況。流式細胞儀發現：敲除EVI1基因之后，可以使細胞周期阻滯在G1期（圖1D）。使用western blot檢測調控細胞周期的因子，發現敲除EVI1基因之后，cyclinD1和E2F1表達水平下降（圖1E）。

圖1 （A）左圖：RT-PCR驗證實驗組、對照組EVI1的分別表達量，右圖：western blot驗證實驗組、對照組EVI1的分別表達量。（B）MTT實驗檢測實驗組、對照組細胞生長速率。（C）平板克隆實驗檢測實驗組、對照組細胞形成克隆的能力。（D）流式細胞儀檢測實驗組、對照組細胞周期分別的差異。（E）western blot驗證實驗組、對照組cyclinD1和E2F1的分別表達量。

2.2 EVI1可促進胃癌細胞的侵襲能力

研究EVI1基因對胃癌細胞侵襲能力的影響。進行transwell實驗，驗證細胞的侵襲能力。結果發現：與對照組相比，實驗組細胞侵襲能力下降（圖2A）。檢測影響胃癌細胞侵襲的金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）的表達。結果發現：敲除EVI1基因之后，MMP3和MMP9表達水平下降（圖2B）。

2.3 EVI1可激活胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路

探索EVI1基因對胃癌細胞影響的可能機制。由于PI3K/AKT信號通路可以促進胃癌細胞的增殖及侵襲能力，研究EVI1是否可以通過激活PI3K/AKT信號通路，從而發揮相關生物學作用。

我們使用western blot實驗，檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白質在實驗組和對照組之間的表達差異。結果發現：和對照組相比，實驗組細胞中磷酸化PI3K及磷酸化AKT表達水平都下調（圖2C）。這結果提示：EVI1可能激活PI3K/AKT信號通路。

圖2 （A）transwell實驗驗證實驗組、對照組細胞遷徙數目。（B）western blot驗證實驗組、對照組MMP3和MMP9的分別表達量。（C）western blot驗證實驗組、對照組磷酸化PI3K（p-PI3K）及磷酸化AKT（p-AKT）的分別表達量。

2.4 EVI1在胃癌組織中表達上升

最后，探討EVI1蛋白在腫瘤組織，尤其胃癌組織中的表達情況。使用TCGA（The Cancer Genome Atlas）在線分析數據庫（http：//tumorsurvival.org/）來分析EVI1蛋白在腫瘤組織中的表達情況。發現：EVI1蛋白在一系列腫瘤組織中表達都上升，尤其是在胃癌組織中（圖3）。

圖3 TCGA數據庫中EVI1蛋白在一系列惡性腫瘤中的表達水平（紅色圈部分代表胃癌組織）。

3.討論

胃癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，患者具有生存時間較短，容易復發及遠處轉移的特點。同時，胃癌發病隱匿性較高，很多患者確診的時候已經是疾病的晚期狀態[2]。因此，闡明胃癌發病的分子機制，尋找新的可以預測胃癌發病的相關分子，并開發新的治療靶點，在臨床治療中具有重要的意義。

研究擬探討EVI1基因在胃癌中的作用及具體的分子機制。EVI1是一個重要的癌基因，在包括急性白血病，卵巢癌，結腸癌，肺癌，鼻咽癌等多種惡性腫瘤中高度表達[3]。EVI1高度表達的腫瘤患者其預后不良，這類患者其無疾病生存時間及總生存時間通常短于低表達的患者[4]。這提示EVI1有可能作為惡性腫瘤一個預后監測的指標，并有可能作為一個新的治療靶點。EVI1的生物學作用在胃癌中的研究相對比較少，本研究擬初步探討其在胃癌細胞中的功能。

在既往的研究當中，發現EVI1可通過多種途徑促進腫瘤的發生以及進展。例如在乳腺癌當中，EVI1可以促進細胞的增殖，調控細胞周期，從而導致細胞的生長[5]。在卵巢癌細胞中，EVI1可以促進細胞的侵襲，從而導致了腫瘤的遠處轉移。EVI1還可以賦予腫瘤細胞對凋亡的抵抗，從而促進了腫瘤細胞的生長，以及對化療的抵抗[6]。在白血病細胞當中，EVI1還可以直接結合在其下游基因的啟動子水平，發揮廣泛的基因調控作用，從而促進白血病的發生進展[7]。EVI1還可以和microRNA(miRNA)相互結合，從而間接調控miRNA下游的靶基因，發揮一系列廣泛的生物學功能[8]。從這些研究結果，可以看出EVI1是具有很廣泛的調控腫瘤的作用。

在我們的研究當中，首先在胃癌細胞中敲除EVI1的表達，然后開始研究相關的生物學功能。MTT和平板克隆結果提示，在敲除EVI1之后，胃癌細胞的生長能力下降。腫瘤細胞的生長受到多個因子及因素的調控。還進一步發現，EVI1可以促進腫瘤細胞由G1期進入S期。對調控細胞周期的相關蛋白進行驗證后，我們還發現EVI1可以上調cyclinD1和E2F1的表達。這結果和之前的研究結果相一致[9,10]。還用transwell實驗驗證EVI1對胃癌細胞的影響。結果發現：敲除EVI1之后，胃癌細胞侵襲的能力下降。金屬基質蛋白酶過度表達可以促進腫瘤細胞的侵襲以及遠處轉移，包括胃癌細胞[11]。結果發現EVI1可以上調胃癌細胞金屬基質蛋白酶中的MMP-3和MMP-9表達水平。這提示EVI1有可能是通過調控金屬基質蛋白酶，從而促進胃癌細胞的侵襲能力。綜上所述，這些研究結果進一步證明了EVI1對腫瘤細胞生長和侵襲能力的影響。

最后，我們還探討了EVI1可能促進胃癌細胞生長及侵襲的分子機制。在之前的研究當中，發現EVI1可以直接抑制PTEN，從而激活PI3K/AKT信號通路[12]。EVI1還可以激活ERK/mTor通路，從而促進腫瘤細胞的侵襲及化療抵抗[13]。PI3K/AKT信號通路通常在腫瘤細胞中是異常激活的。在胃癌細胞中，PI3K/AKT信號通路可以促進細胞的增殖以及侵襲[14]。我們探討了EVI1對PI3K/AKT信號通路活性的影響。我們發現：敲除EVI1之后，PI3K/AKT信號通路活性下降。由此可見，EVI1是通過PI3K/AKT信號通路促進了胃癌細胞的增殖及侵襲能力。

綜上所述，EVI1可以促進胃癌細胞的生長、侵襲能力。其中的機制可能是EVI1激活了PI3K/AKT信號通路。EVI1可做為胃癌治療的一個新靶點。