HPLC法對壯瑤藥狗仔花中綠原酸和咖啡酸含量的測定

郭海姣 劉進(jìn)寶 胡華 王先軍 劉雯

摘要：建立一種同時測定壯瑤藥狗仔花中咖啡酸和綠原酸含量的HPLC方法。色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫;流量為1.0 mL/min;檢測波長為327 nm;柱溫為25 ℃。結(jié)果表明，綠原酸和咖啡酸分別在47.84～239.2 μg/mL（R=0.999 8）、10.05～50.25 μg/mL（R=0.999 9）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為96.69%、102.10%，RSD分別為0.74%、2.00%。試驗(yàn)建立了HPLC法測定狗仔花中綠原酸、咖啡酸含量的方法，該方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠，重現(xiàn)性較好，可用于壯瑤藥狗仔花的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：狗仔花;綠原酸;咖啡酸;HPLC

中圖分類號：O657.7+1;S567.21+9?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0188-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.038

Abstract： To establish a method for the determination of caffeic acid and chlorogenic acid Vernonia patula by HPLC. The separation was performed on Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）with the acetonitrile-0.2% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase with gradient elution. The volume flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 327 nm. The column temperature was 25 ℃. The linear range of caffeic acid and chlorogenic acid were 47.84～239.2 μg/mL（R=0.999 8）、10.05～50.25 μg/mL（R=0.999 9），and the average recoveries （n=6） were 96.69%（RSD=0.74%）、102.10%（RSD=2.00%）. This paper established a method for the contents of chlorogenic acid and caffeic acid in Vernonia patula. The method is accurate，sensitive，credible and repeatable. It can be applied to the quality control of Vernonia patula.

Key words： Vernonia patula; chlorogenic acid; caffeic acid; HPLC

狗仔花系菊科斑鳩菊屬植物咸蝦花（Vernonia patula）的全草，主產(chǎn)于中國福建、臺灣、廣東、廣西、貴州、云南等省區(qū)，資源豐富。狗仔花是傳統(tǒng)壯瑤藥，應(yīng)用歷史悠久，具有發(fā)表散寒、涼血解毒、清熱止瀉之功效，主要用于感冒發(fā)熱、瘧疾、熱瀉、痧氣、濕疹、蕁麻疹、久熱不退、高血壓、乳腺炎等[1]，臨床療效顯著，應(yīng)用范圍較廣。目前國內(nèi)外學(xué)者對斑鳩菊屬植物的研究較多，通過研究發(fā)現(xiàn)其主要成分為倍半萜類、三萜、黃酮、甾體、揮發(fā)油等，展現(xiàn)了多方面的藥理活性，如抗腫瘤、抗真菌、抗瘧等[2]。但對斑鳩菊屬植物咸蝦花研究較少，其中有部分學(xué)者對其化學(xué)成分進(jìn)行了研究，分離得到了苯丙素類化合物和倍半萜類化合物[3-5];有學(xué)者對其藥理作用進(jìn)行了研究，認(rèn)為狗仔花具有抗炎與抗氧化活性[6]。

中藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，是中醫(yī)臨床防病治病的最主要物質(zhì)手段。中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不完善是阻礙中藥產(chǎn)業(yè)走向現(xiàn)代化與國際化的障礙。中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究一直是中藥發(fā)展的關(guān)鍵，決定著中藥的安全性和有效性[7]。在《廣西壯族自治區(qū)壯藥標(biāo)準(zhǔn)》第三卷及《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第一卷中，均收錄了狗仔花，但該標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量控制項(xiàng)目只有性狀鑒別項(xiàng)，難以全面地控制狗仔花的質(zhì)量，因此，為了保證狗仔花臨床應(yīng)用的有效性與安全性，完善狗仔花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。試驗(yàn)擬通過HPLC法測定其綠原酸、咖啡酸含量，為狗仔花質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，包括UV型紫外檢測器、安捷倫工作站（美國安捷倫公司）;密思博超純水器;SQP十萬分之一電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;KQ5200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。水為純凈水;甲醇為分析純;乙腈為色譜純。試驗(yàn)用對照品綠原酸（批號110753-201716，含量99.3%）和咖啡酸（批號110885-201703，含量99.7%）購自中國食品藥品檢定研究院。狗仔花（批號：20160401、20161101、20170101）均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室譚勇教授鑒定為菊科斑鳩菊屬植物咸蝦花。

1.2?方法

1.2.1?色譜條件?Welch Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）;梯度洗脫（0～10 min，10%～20%A;10～15 min，20%～25%A;15～20 min，25%～100%A;20～25 min，100%～100%A）;流速1.0 mL/min;檢測波長327 nm;供試品溶液進(jìn)樣量10 μL，對照品溶液進(jìn)樣量5 μL;柱溫25 ℃。

1.2.2?溶液的制備

1）對照品溶液的制備。精密稱取綠原酸對照品粉末9.20 mg于10 mL容量瓶中，加適量甲醇使其完全溶解，再加甲醇定容搖勻，即得綠原酸儲備液;同上述方法精密稱取咖啡酸對照品粉末6.70 mg于10 mL容量瓶中并定容，得咖啡酸儲備液。依次精密量取綠原酸儲備液2.6 mL、咖啡酸儲備液0.75 mL，置于同一個5 mL的棕色容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得含綠原酸478.4 μg/mL、咖啡酸100.5 μg/mL的對照品混合溶液。

2）供試品溶液的制備。精密稱取狗仔花粗粉（過2號篩）約5 g，置帶塞磨口錐形瓶中，用移液管精密量取25 mL 75%甲醇倒入錐形瓶，稱重，超聲處理20 min，放涼，用75%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過。取上清液過0.45 μm微孔濾膜即得。

1.3?方法學(xué)考察

1.3.1?線性關(guān)系考察?用移液管分別精密移取“1.2.2”制備的對照品混合溶液1、2、3、4、5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，制得一系列不同濃度的對照品混合溶液。分別取適量上述對照品混合溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，按“1.2.1”的檢測洗脫條件進(jìn)樣分析。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2?精密度試驗(yàn)?取對照品混合溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，上機(jī)測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算被測組峰面積RSD值。

1.3.3?重復(fù)性試驗(yàn)?精密稱取狗仔花粗粉（過2號篩，批號：20160401）約5 g，平行稱取6份，得到狗仔花供試品溶液。按“1.2.1”條件測定，記錄被測組分峰面積RSD值。

1.3.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)?供試品溶液在配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，按“1.2.1”測定，記錄被測組色譜峰面積，計(jì)算被測組峰面積RSD值。

1.3.5?加樣回收率試驗(yàn)?精密稱取狗仔花粗粉（過2號篩，批號：20160401）2.5 g，平行稱取6份樣品，按照相當(dāng)于樣品中含量100%的比例分別精密加入對照品適量，按“1.2.1”條件測定，記錄被測組峰面積，計(jì)算平均回收率。

2?結(jié)果與分析

2.1?系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液5、10 μL按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果如圖1所示，理論板數(shù)以綠原酸計(jì)≥3 000。

2.2?方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1?線性關(guān)系考察?用移液管分別精密移取“1.2.2”制備的對照品混合溶液1、2、3、4、5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，定容。分別取適量上述不同濃度對照品混合溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，按“1.2.1”進(jìn)樣分析。以被測組分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對照品質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得綠原酸線性回歸方程為Y=1 781.7X+807.34，相關(guān)系數(shù)0.999 8;咖啡酸線性回歸方程為Y=3 933.3X+13.86，相關(guān)系數(shù)0.999 9，說明綠原酸、咖啡酸質(zhì)量濃度分別在47.84～239.2、10.05～50.25 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2?精密度試驗(yàn)?取對照品混合溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，上機(jī)測定。按“1.2.1”方法重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄被測組峰面積，計(jì)算被測組綠原酸、咖啡酸峰面積RSD值分別為0.41%、0.13%，說明儀器精密度良好。

2.2.3?重復(fù)性試驗(yàn)?平行稱取6份狗仔花粗粉（過2號篩，批號：20160401），每份5 g，按“1.2.1”方法進(jìn)行分析，記錄被測組峰面積，計(jì)算得綠原酸平均含量為0.026 2%，RSD值為2.7%;咖啡酸平均含量為0.007 0%，RSD值為2.8%，說明試驗(yàn)所建立的方法重復(fù)性良好。

2.2.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取適量供試品溶液，在配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，記錄被測組色譜峰面積，計(jì)算被測組峰面積RSD值。測得到綠原酸、咖啡酸的RSD值分別為2.1%、2.8%，表明該方法制得的狗仔花供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5?加樣回收率?平行稱取6份狗仔花粗粉（過2號篩，批號：20160401），每份約2.5 g，按照相當(dāng)于樣品中含量100%的比例分別精密加入對照品適量，按“1.2.1”方法進(jìn)行分析，記錄被測組峰面積，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表1。通過計(jì)算得到狗仔花中綠原酸平均回收率為96.69%，RSD值為0.74%;咖啡酸平均回收率為102.10%，RSD值為2.00%，表明加樣回收率良好。

2.3?樣品測定

取3批不同批次的狗仔花樣品，按“1.2.2”方法提取;按“1.2.1”方法進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表2可以看出，不同批次狗仔花綠原酸、咖啡酸含量相差較大，說明狗仔花的質(zhì)量差異較大，應(yīng)該嚴(yán)格控制狗仔花的質(zhì)量。

3?討論

狗仔花是傳統(tǒng)壯瑤藥，臨床應(yīng)用廣泛。完善狗仔花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對保證狗仔花臨床應(yīng)用、推廣狗仔花的臨床應(yīng)用和資源開發(fā)具有重要意義。關(guān)于狗仔花指標(biāo)性成分的含量測定研究鮮有報道，試驗(yàn)建立了HPLC法對狗仔花中綠原酸、咖啡酸含量進(jìn)行測定，該方法能夠有效控制狗仔花中綠原酸、咖啡酸的含量，且簡便可行，耗時較短，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

參考文獻(xiàn)：

[1] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局. 廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第三卷）[M]. 南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2017.

[2] 邱?濰，陳?新，章?慧. 咸蝦花的化學(xué)成分研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（4）：181-183.

[3] 孫?力，巴玉蘭，于魯海，等. 斑鳩菊屬植物藥理活性研究進(jìn)展[J]. 新疆中醫(yī)藥，2009，27（6）：82-85.

[4] 梁僑麗，閔知大. 咸蝦花化學(xué)成分的研究[J]. 中國中藥雜志，2003（3）：46-48.

[5] 梁僑麗，蔣繼宏，閔知大. 咸蝦花中的牻牛烷型倍半萜內(nèi)酯[J]. 中國天然藥物，2010，8（2）：106-109.

[6] HIRA A，DEY S K，HOWLADER M S，et al. Anti-inflammatory and antioxidant activities of ethanolic extract of aerial parts of Vernonia patula （Dryand） Merr[J].Asian pacific journal of tropical biomedicine，2013，3（10）：798-805.

[7] 佘一鳴，胡永慧，韓立云，等. 中藥質(zhì)量控制的研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2017，48（12）：2557-2563.