薏仁多糖的提取工藝優化及其抗氧化與透皮吸收作用

李樹萍 彭俊超 李萌 安全 王昌濤 趙丹

摘要：對薏仁多糖的水提和發酵的提取條件進行了優化，并研究了薏仁多糖提取液抗氧化活性和透皮吸收效果。結果表明，薏仁多糖水提的最佳條件為料液比0.11（g/mL），溫度90 ℃，時間7 h;發酵最佳條件為釀酒酵母，料液比0.1（g/mL），時間54 h，pH 4.5;薏仁多糖發酵提取率約為水提的3倍。薏仁多糖發酵液抗氧化性優于水提液;薏仁多糖發酵液24 h透過率為1.14 mg/cm2，水提液24 h透過率為0.53 mg/cm2。

關鍵詞：薏仁多糖;水提;發酵;抗氧化;透皮吸收

中圖分類號：TQ464.1; R284?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0174-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.035

薏仁（Coix seed）又名薏苡仁、苡米、苡仁等，在河北、陜西、河南等地區產量豐富，被稱為“世界禾本科植物之王”[1]。薏仁中含人體所需的亮氨酸、精氨酸等必需氨基酸以及礦物質 [2]，且薏仁中的薏八醇及β、γ兩種谷甾醇具有很高的藥用價值，這也是薏米具有防癌作用的秘密所在 [3]。薏米淀粉糊性質穩定，沉降速度較緩慢，較之其他淀粉類的成品不易老化[4]。薏仁不飽和脂肪酸含量較高，且含有具有抗氧化性很強的奇數碳鏈脂肪酸，具有減輕血液中超量膽固醇、加大細胞膜透性、阻遏心肌組織與動脈硬化等功能[5]。薏仁多糖是薏仁的主要有效成分之一，徐梓輝等[6]運用四氧嘧啶破壞胰島細胞，建立了糖尿病小鼠的模型，研究發現薏仁多糖對阻遏肝糖原分解、肌糖原酵解和抑制糖異生具有一定效用，由此達到降低血糖濃度的作用[6]。植物多糖有許多藥理作用如免疫調節、抗腫瘤作用[7-13]，降血糖、血脂作用[14-17]，抗輻射、抗菌、抗病毒作用[18-20]，抗氧化、抗衰老作用[21-23]等。本研究旨在通過對薏仁的水提、發酵試驗，優化薏仁多糖的提取條件，以達到對薏仁的充分利用。同時，研究其抗氧化性，并通過透皮吸收實驗，對發酵與水提多糖的透皮吸收效果進行比較，為其在人體抗衰老及透皮吸收中的應用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

鼠皮購自北京海淀區興隆實驗動物養殖廠，薏仁為市售;維生素C購自國藥集團化學有限公司;Tris堿、濃HCL、硫酸、苯酚、葡萄糖、DPPH、焦性沒食子酸購自北京化工廠。

BS2202S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）;RJ-TGL-16B型離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）;T6新世紀型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;DSHZ-300型恒溫水浴振蕩器（江蘇省太倉市實驗設備廠）;HH.S21-Ni4型電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）;YT-CJ-1ND型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術公司）;HC-268型透皮擴散池（天津正通科技有限公司）;A2492型分析天平（北京福海科技技術有限公司）;HH·SY21-Ni4型恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）。

1.2?試驗方法

1.2.1?薏仁多糖提取工藝?熱水浸提法：薏仁粉碎后過40目篩，熱水浸提，以1 800 r/min的轉速離心10 min后量取上清液;微生物發酵法：取乳酸菌/酵母菌進行菌種活化，待菌種生長至對數期，取200 μL菌液進行接種，發酵提取，并在121℃下滅菌30 min，1 800 r/min離心10 min后量取上清液。

1.2.2?薏仁多糖樣品含量測定?多糖含量的測定參考文獻[24]。

1.2.3?水提薏仁多糖的單因素探究?料液比對提取率的影響：提取溫度80 ℃，時間6 h，pH?5。選 取 5個液料比梯度?0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 （g/mL），取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

溫度對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），pH 5，時間6 h，選取5個溫度梯度50、60、70、80、90 ℃。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

pH對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），提取溫度80 ℃，時間6 h，選取5 個pH梯度 4、5、6、7、8 。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

提取時間對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），提取溫度80 ℃，pH 5。選取5個時間梯度2、4、6、8、10 h。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

薏仁多糖提取率=薏仁多糖濃度×提取液總體積/薏仁干重×100%

正交試驗設計：在單因素優化的基礎上進行正交試驗，采用三因素三水平法進行設計，以確定提取多糖的最佳工藝（表1）。

1.2.4?發酵法提取薏仁多糖的單因素探究?菌種對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），時間36 h。乳酸菌：溫度37 ℃，pH 6.5;酵母菌：溫度28℃，pH 5.0。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

料液比對提取率的影響：時間36 h，pH 5.0（酵母菌）和6.5（乳酸菌）。料液比梯度0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 （g/mL）。取一定量的多糖溶液測定多糖含量，從而得到提取率。

提取時間對提取率的影響：料液比0.1 （g/mL），pH 5.0（酵母菌）和6.5（乳酸菌）。時間梯度12、24、36、48、60 h。取一定量的 多糖溶液測定多 糖 量，從而得到提取率。

pH對提取率的影響：料液比0.1 g/mL，時間36 h。pH梯度4、5、6、7、8。取一定量的 多糖溶液測定多糖含 量，從而得到提取率。

薏仁多糖提取率=薏仁多糖濃度×提取液總體積/薏仁干重×100%

正交試驗設計：在單因素優化的基礎上進行正交試驗，采用三因素三水平法進行設計，以確定提取薏仁多糖的最佳工藝（表2）。

1.2.5?薏仁多糖提取液抗氧化活性檢測?對DPPH自由基清除作用的測定：取3 mL薏仁多糖提取液（不同梯度：稀釋至1、2、4、8、16倍）與2×10-4?mol/L的DPPH溶液3 mL混勻，作為A1管;取3 mL的無水乙醇與濃度為2×10-4?mol/L的DPPH溶液3 mL混勻，作為A2管;取3 mL的無水乙醇與薏仁多糖提取液3 mL混勻，作為A3管;反應30 min，在517 nm下分別測定A1、A2、A3管吸光度。清除率計算公式：清除率（%）=[（A2+A3）-A1]/A2×100%

對超氧陰離子清除作用的測定（鄰苯三酚自氧化法）：取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，在25 ℃水浴中預熱20 min;加入0.1 mL不同濃度梯度的薏仁多糖提取液和0.4 mL的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應5 min;滴加8 mol/L 鹽酸1.0 mL，終止反應;將Tris-HCl緩沖液作參照，以0.1 mL蒸餾水代替薏仁多糖提取液作為空白對照組，在299 nm處測定吸光度，計算其清除率。取不同濃度薏仁多糖提取液各0.1 mL，加超純水5.9 mL，測量其在299 nm處的吸光度，讀數為A本底。超氧陰離子自由基清除率= （A1-A2+A本底）/A1×100%（A1為空白組平均吸光度，A2為試樣組平均吸光度）。

1.2.6?透皮吸收試驗?制備鼠皮：將豚鼠麻醉后斷頸致死，處理其腹部毛發，涂抹脫毛膏并放置5 min后刮去，生理鹽水清洗，后剝取其腹部皮膚，去除皮下脂肪并洗凈，用保鮮膜包裹，置于-20 ℃冷藏備用。將豚鼠皮膚固定于擴散池上下室之間，接受池盛取生理鹽水，樣品池（沒有多糖）則盛取5 mL薏仁多糖提取液。在32 ℃下以400 r/min不間歇攪拌，之后于0、1、2、4、6、8、10、12、24 h分別吸取1 mL接受液，并補充1 mL的生理鹽水。每個樣品做3個平行試驗。

2?結果與分析

2.1?水提法單因素優化結果

2.1.1?料液比對提取率的影響?水提薏仁多糖的提取率受多種因素影響，料液比就是其中之一。料液比是指薏仁的質量與作為浸提液水的體積的比（g/mL）。如圖1所示，在薏仁多糖的料液比作為變量時，可以發現薏仁多糖的提取率受到其影響較大。在料液比0.05～0.10 （g/mL）時，提取率急劇地上升，在0.10 （g/mL）時，其提取率達到峰值，而在0.10 （g/mL）以后，其提取率卻逐漸下降，這可能是由于薏仁溶液相對過于濃稠，導致其提取率下降。

2.1.2?溫度對提取率的影響?溫度的高低是影響水提薏仁多糖提取率的又一因素。如圖2所示，在薏仁多糖的提取溫度為變量時，提取率變化范圍較大，在80 ℃以前提取率不高，而在90 ℃時則急劇上升，薏仁多糖的提取率隨溫度升高而升高，這可能是因為溫度達到一定值時，其相關反應較為劇烈。

2.1.3?pH對提取率的影響?pH對水提薏仁多糖的提取率也有影響（圖3）。pH為4～6時，提取率是緩慢上升的;當pH為6時，其提取率達到巔峰，之后提取率有所下降。可能薏仁多糖對偏酸性的環境較為適應，故提取率較高。不過總體來說，pH對薏仁多糖提取率的影響不大。

2.1.4?提取時間對提取率的影響?提取時間的長短也會影響水提薏仁多糖的提取率。由圖4可知，薏仁多糖的提取時間為2～6 h時，薏仁多糖的提取率是逐漸升高的，其在6 h時達到峰值，6 h后其提取率逐漸下降，原因可能是隨著時間的增加薏仁多糖降解，從而導致其提取率降低。

2.2?發酵法提取單因素優化結果

2.2.1?不同菌種對提取率的影響?不同的菌種對發酵法提取薏仁多糖的提取率影響不同。由圖5可知，從保加利亞乳桿菌和釀酒酵母這兩種常見菌種中選取，釀酒酵母在適宜環境下的提取率較保加利亞乳桿菌更高，因此，發酵提取的3個單因素條件的菌種選取釀酒酵母。

2.2.2?液料比對提取率的影響?在其他條件固定的情況下，以薏仁多糖的料液比作為惟一的變量時，由圖1可知，當料液比在0.10 （g/mL）時，薏仁多糖的提取率達到峰值，之后薏仁多糖的提取率逐漸降低，這可能是由于在料液比較高時發酵不夠充分。

2.2.3?提取時間對提取率的影響?當其他條件固定、薏仁多糖的提取時間為惟一的變量時，由圖6可知，在時間為48 h時，提取率達到峰值，在12～48 h，隨時間的增加而提取率升高，48 h后則有所下降。推測其提取率下降的原因可能是部分多糖分解，也可看出提取時間對發酵法的影響較大。

2.2.4?pH對提取率的影響?在發酵提取薏仁多糖時，若保持其他條件不變，僅pH變化時，由圖7可知，在pH 4～5時提取率是升高的，在pH 5時達到峰值，而后有所衰減，表明pH對發酵提取薏仁多糖具有一定的影響。

2.3?水提法和發酵法提取薏仁多糖的正交條件優化結果

2.3.1?水提法正交試驗?由表3的極差分析可知，水提法提取薏仁多糖最佳組合為A3B2C3，即料液比0.11（g/mL）、溫度90 ℃、提取時間7 h。水提法提取薏仁多糖因素的排序為：料液比>提取溫度>提取時間。最后，根據優化結果提取薏仁多糖，提取率為3.83%。

2.3.2?發酵法正交優化?由極差分析可知，發酵法提取薏仁多糖最佳組合為A3B2C1，即提取時間54 h、pH 4.5、料液比0.1（g/mL）。影響發酵法提取薏仁多糖因素的排序為：提取時間>pH>料液比。按照優化結果提取薏米多糖，提取率為11.50%。

2.4?薏仁多糖抗氧化性研究試驗結果

2.4.1?DPPH清除率?由圖8可知，薏仁多糖水提液的DPPH清除效率較高，在未稀釋時可達到約68%，而在稀釋約4倍后清除率小于50%，隨著其稀釋比例增加其清除率降低較多。發酵法所得的薏仁多糖的DPPH清除率較高，其在未稀釋時可達到約74%，而在稀釋約4倍后清除率小于50%，隨著稀釋比例增加其清除率降低較多。

2.4.2?超氧陰離子清除率結果分析?超氧陰離子具有免疫和信號轉導的作用，但積累過多會對細胞膜及生物大分子產生破壞作用，導致機體細胞和組織代謝異常，從而引起多種疾病。由圖9可知，水提所得薏仁多糖的超氧陰離子清除效率較低，其在未稀釋時可達到約47%的清除率。薏仁多糖發酵液的超氧陰離子清除效率較高，其在未稀釋時可達到約66%的清除率，稀釋2倍后則清除率小于50%，其后清除率隨著稀釋比例的增加而逐漸下降。

2.5?透皮吸收試驗結果

2.5.1?水提最優條件透皮結果?透皮吸收是指外用制劑（薏仁提取液）施于正常的皮膚表面（鼠皮）后，吸收進入全身血液循環的過程。由圖10可知，試驗時間為0～8 h時，其吸收效果迅速上升，在8 h時達到峰值，而在8 h之后其吸收則是有所衰減，直至趨于不變。薏仁多糖水提液24 h透過率為0.53 mg/cm2。

2.5.2?發酵最優條件透皮結果?由圖10可知，發酵法的吸收效果比較反復，其在10 h時達到峰值，之后吸收效果則是有反復。薏仁多糖發酵液24 h透過率為1.14 mg/cm2。

3?結論

通過正交優化薏仁多糖的條件發現：水提薏仁多糖最佳條件為料液比0.11（g/mL），溫度90 ℃，時間7 h。水提法薏仁多糖影響因素的排序為料液比>提取溫度>提取時間。最后，根據優化結果提取薏仁多糖，提取率為3.83%。發酵法提取薏仁多糖最佳條件為釀酒酵母，料液比0.1（g/mL），時間54 h，pH 4.5，發酵法薏仁多糖影響因素的排序為提取時間>pH>料液比。最后，根據優化結果提取薏仁多糖，提取率為11.50%。發酵法提取薏仁多糖的提取率約為水提法的3倍，此結果為薏仁的充分利用提供了技術依據。根據薏仁多糖對DPPH和超氧陰離子的清除作用可知，薏仁多糖發酵液抗氧化性優于水提液。薏仁多糖發酵液24 h透過率為1.14 mg/cm2，水提液24 h透過率為0.53 mg/cm2。表明薏仁多糖發酵液透皮效果優于薏仁水提液。由于小鼠存在個體吸收效果差異，同時需要3只小鼠，其生理狀況也不同，均會導致試驗結果受到影響。

本研究通過對薏仁提取多糖的水提法和發酵法工藝進行優化，并對兩種多糖的抗氧化效果和透皮吸收效果進行了檢測。結果表明，發酵法提取薏仁多糖提取率更高，同時發酵法提取得到的薏仁多糖在抗氧化性和透皮吸收方面效果均優于水提法，以上結果為發酵薏仁多糖作為潛在的抗氧化化妝品、食品的開發提供了一定的數據參考。

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