結腸癌中miR-592、SOX9的表達與臨床病理特征及預后的關系

陳玉昌，吳秋菊

1.長武縣人民醫院內科，陜西 咸陽 713600；2.渭南市第二醫院消化內科，陜西 渭南 714000

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在男性和中老年人群中發病率較高，病死率極高。近年來，由于人們飲食結構改變、吸煙酗酒等不良習慣增加，結腸癌發病處于上升趨勢。若結腸癌不能得到有效診斷和治療，將嚴重威脅人類生命健康[1]。研究發現，微小RNA(MicroRNA，miRNA)-592 在肝癌細胞中下調，與肝癌患者淋巴結轉移、腫瘤侵襲及生存率降低等相關[2]。神經膠質瘤組織中miR-592也被證實低表達，上調其表達能顯著抑制該腫瘤細胞生長，促進細胞凋亡[3]。Sry相關組蛋白9 (Sry related HMG box 9，SOX9)是一種與細胞增殖、分化密切相關的核轉錄因子。近年研究發現，SOX9 蛋白高表達與肝癌患者不良預后有關[4]。SOX9表達上調可通過調控表皮生長因子受體家族基因ERBB 表達促進胰腺癌進展[5]。然而miR-592 和SOX9 與結腸癌的關系未見研究。本研究通過檢測miR-592、SOX9 在結腸癌組織中表達情況，分析其與患者臨床病理特征及預后關系，探討其在結腸癌進展中意義及對預后評估價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010 年2 月至2016 年2 月在長武縣人民醫院治療的106例結腸癌患者為研究對象。納入標準：①臨床病理檢查確診為結腸癌；②術前未進行放、化療者；③臨床及隨訪資料完整。排除標準：①合并患有其他部位腫瘤者；②心、腎、肝臟等功能嚴重不足者；③患有嚴重精神疾病者。106 例患者中男性62例，女性44例；年齡31～73歲，平均(58.35±18.39)歲；根據美國癌癥聯合會TNM分期(第八版)[6]中的標準：Ⅰ期23例，Ⅱ期36例，Ⅲ期47例；按腫瘤部位分類：左半結腸52 例，右半結腸54 例；按分化程度分類：高分化32例、中分化44例、低分化30例；按浸潤程度分類：T1～T250 例，T3～T456 例。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 主要儀器和試劑 熒光定量PCR 儀(型號：Mx3005P，美國Stratagene 公司)，光學顯微鏡(型號：DM500，德國徠卡公司)。反轉錄試劑盒(貨號：RR047a，日本TaKaRa公司)，實時熒光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：DRR041A，日本TaKaRa公司)，免疫組織化學染色試劑盒(貨號：8841-6599-45，美國Invitrogen 公司)，兔抗人SOX9 多克隆抗體(貨號：PA5-86301，美國Invitrogen公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集 收集入組結腸癌患者經手術切除的癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤部位＞5 cm)。一部分放入液氮中迅速冷卻之后，研磨并用Trizol 法提取RNA，經反轉錄后將所得cDNA 于-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR實驗。另一部分用10%福爾馬林溶液中固定后，制成4 μm厚石蠟切片用于免疫組織化學染色實驗。

1.3.2 qRT-PCR檢測miR-592及SOX9 mRNA表達水平 使用qRT-PCR試劑盒配制實驗所用反應體系，20 μL 反應體系如下：50×ROX Reference Dye 0.4 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μ L，cDNA 2 μ L，DEPC 處理水6.8 μ L。qRT-PCR 反應程序如下：第一步95℃，30 s。第二步95℃，10 s；61℃，33 s；40℃，1 min，第二步40 個循環。一個樣品三個重復，使用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。本次qRT-PCR所用引物如表1所示，miR-592以U6為內參基因，SOX9以GAPDH為內參基因。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組織化學染色 (1)染色方法：SOX9抗體稀釋比為1：100，按照免疫組化染色試劑盒說明書進行實驗。切片經二甲苯、酒精脫蠟、脫水后后用H2O2溶液浸泡15 min。在檸檬酸鹽緩沖液中加熱10 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗切片3次。甩干后滴加0.25%牛血清蛋白，室溫孵育40 min。加SOX9 抗體，4℃孵育14 h。復溫90 min、PBS 清洗后加生物素標記的二抗39℃下孵育25 min，取出后用PBS 清洗3 次，每次5 min。用DAB 顯色劑顯色，10 min 后蘇木素復染1 min，沖洗、脫水后二甲苯固定，風干后封片。顯微鏡下觀察，并采集圖像資料，400倍鏡下選擇5個視野記錄陽性細胞數。(2)染色結果判定：細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。分別根據染色強度和陽性細胞比例記分。①染色強度：無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2 分，棕褐色記3 分。②陽性細胞比例：＜5%記0分，5%～25%記1 分，26%～50%記2 分，51%～75%記3分，＞75%記4分。兩種記分相乘，0 分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8 分為陽性(++)，9～12 分為強陽性(+++)，其中陰性(-)、弱陽性(+)定義為高表達，陽性(++)、強陽性(+++)為低表達。

1.4 隨訪 入組患者經治療出院后，以電話或復查方式對其進行3 年隨訪，每3 個月1 次，隨訪期間觀察并記錄患者生存情況。

1.5 統計學方法 應用SPSS22.0 軟件對本研究中數據進行分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t 檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用Pearson 法進行相關性分析；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，行log-rank檢驗；用Cox比例風險回歸模型進行危險因素分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織和癌旁組織的miR-592、SOX9 mRNA 表達水平比較 結腸癌組織中的miR-592 表達水平顯著低于癌旁組織，SOX9 mRNA 水平顯著高于癌旁組織，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 結腸癌組織和癌旁組織的SOX9 蛋白表達水平比較 SOX9 蛋白主要在細胞核中表達，結腸癌組織中SOX9 蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=51.080，P＜0.05)，見表3和圖1。

images/BZ_20_1272_781_2269_814.png組別結腸癌組織癌旁組織例數106 106-38 89+30 12images/BZ_20_1875_845_1913_988.png+++12 0陽性率(%)64.15 16.03

表2 結腸癌組織和癌旁組織的miR-592、SOX9 mRNA 表達水平比較(±s)

表2 結腸癌組織和癌旁組織的miR-592、SOX9 mRNA 表達水平比較(±s)

組別結腸癌組織癌旁組織t值P值例數106 106 miR-592/U6 0.56±0.16 0.99±0.30 13.021＜0.05 SOX9/GAPDH 2.38±0.74 1.01±0.32 17.495＜0.05

圖1 結腸癌組織中SOX9蛋白表達(免疫組織化學染色，×400)

2.3 結腸癌組織中miR-592、SOX9 表達水平與臨床病理特征的關系 將入組患者以結腸癌組織中miR-592 表達水平平均數(0.59)和SOX9 蛋白免疫組織化學染色結果，分為高表達組和低表達組。結腸癌組織中miR-592、SOX9 表達水平與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位無關(P＞0.05)，與分化程度、浸潤程度、TNM 分期、淋巴結轉移、遠處轉移有關(P＜0.05)，見表4。

表4 miR-592、SOX9表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]

2.4 結腸癌組織中miR-592、SOX9 mRNA表達相關性 如圖2 所示，結腸癌組織中miR-592 與SOX9 mRNA表達水平呈負相關(r=-0.562，P＜0.05)。

圖2 結腸癌組織中miR-592與SOX9相關性分析

2.5 miR-592和SOX9表達與結腸癌患者預后相關性 通過Kaplan-Meier 生存分析可知，miR-592 低表達組患者3 年生存13 例，死亡46 例；miR-592 高表達組患者3年生存32例，死亡15例。miR-592低表達組患者3年總生存率為22.03%，明顯低于高表達組患者的68.08%，差異有統計學意義(P＜0.05)。

SOX9 高表達組患者3 年生存16 例，死亡52 例；SOX9 低表達組患者3 年生存29 例，死亡9 例。SOX9 高表達組患者3 年總生存率為42.11%，明顯低于低表達組患者的76.32%，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 Kaplan-Meier生存分析

2.6 結腸癌患者預后影響因素 Cox 回歸模型單因素分析結果顯示，性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位與結腸癌患者預后無關(P＞0.05)；右半結腸、低分化、T3-T4浸潤、TNM分期Ⅲ期、淋巴結轉移、miR-592低表達、SOX9 高表達是影響結腸癌患者不良預后的危險因素(P＜0.05)。多因素分析結果顯示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴結轉移、miR-592 低表達、SOX9 高表達是影響結腸癌患者不良預后的獨立危險因素(P＜0.05)，見表5。

表5 結腸癌患者預后的影響因素

3 討論

結腸癌患者在患病初期不易被確診，多數患者入院治療時腫瘤已進展至中晚期[7]，臨床探究與結腸癌相關的早期診斷標志物及結腸癌預后影響因子，對提高結腸癌診斷效果、改善患者預后有一定意義。miRNA是一類具有調控功能的短鏈RNA，在腫瘤進展中有調控作用。研究表明，miR-126在結腸癌組織中低表達，可作為結腸癌潛在診斷標志物和治療靶點[8]，miR-375在結腸癌中也被證實顯著下調，可靶向抑制結腸癌細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡[9]，表明多種miRNA與結腸癌進展有關，可能影響結腸癌患者預后。

miR-592屬于miRNA家族，據報道miR-592在乳腺癌組織中明顯下調，體外過表達miR-592可顯著抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[10]。LI等[11]發現，非小細胞肺癌組織中miR-592表達下調，可能作為生物標志物診斷預測非小細胞肺癌發生發展[11]。本研究結果表明，結腸癌組織中miR-592 表達水平顯著降低，差異有統計學意義，與前人在乳腺癌[10]和非小細胞肺癌[11]中研究結果一致，提示miR-592 可能與結腸癌發生有關[10，12]。JIA 等[12]研究報道，miR-592 在肝癌細胞中低表達，與腫瘤分期和淋巴結轉移等有關。本研究發現，miR-592表達水平變化與結腸癌分化程度、浸潤程度、TNM 分期、淋巴結轉移、遠處轉移有關，提示miR-592 低表達可能通過影響結腸癌細胞增殖、侵襲等促進腫瘤分化程度降低、TNM 分期升高、淋巴結轉移及遠處轉移，參與結腸癌進展。

SOX9作為SOX家族轉錄因子一員，具有SOX家族共性，與人類生長發育多種生物過程有關。研究發現，敲除SOX9 可顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖和侵襲[13]。SOX9 被發現在非小細胞肺癌組織中表達上調，與腫瘤轉移有關[14]。另有研究報道，SOX9高表達與胃癌淋巴結轉移和患者低生存率有關[15]。本研究中，SOX9 mRNA在結腸癌組織中表達水平顯著上調，且SOX9蛋白在結腸癌組織中陽性表達率顯著高于癌旁組織，差異均有統計學意義。進一步分析發現，SOX9 蛋白表達水平與分化程度、浸潤程度、TNM 分期、淋巴結轉移有關，與前人在甲狀腺腫瘤[13]和胃癌[15]中研究結果一致，提示SOX9 表達上調可能通過調控癌細胞增殖和遷移，影響腫瘤低分化、TNM分期升高、淋巴結轉移及遠處轉移，促進結腸癌發生發展。

另本研究結果顯示，miR-592 低表達、SOX9 高表達組患者3 年總生存率分別顯著低于miR-592 高表達、SOX9低表達組患者，提示miR-592低表達、SOX9高表達可能預示結腸癌患者生存率低等不良預后。且低分化、T3-T4浸潤、TNM 分期Ⅲ期、淋巴結轉移、miR-592 低表達、SOX9 高表達是影響結腸癌患者不良預后危險因素，進一步提示miR-592、SOX9 可作為評估結腸癌患者不良預后的生物標志物。LI 等[11]研究發現，miR-592 可能通過抑制SOX9 蛋白活性在非小細胞肺癌中作為抑癌因子發揮作用。本研究經Targetscan 網站預測發現，SOX9 是miR-592 的靶基因，且結腸癌組織中miR-592 與SOX9 mRNA 水平呈負相關，提示miR-592和SOX9可能相互作用，共同參與結腸癌發生發展，與LI等[11]在非小細胞肺癌研究中結果相似，但具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，結腸癌組織中miR-592 表達下調、SOX9 表達上調，與腫瘤部位、分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移及患者生存率低等有關，兩者之間可能存在作用機制共同參與結腸癌進展，對結腸癌預后評估有一定意義。但本研究未能深入研究miR-592 與SOX9 相互作用機制，將在下一步研究中進行驗證和探究。