PML在慢性髓系白血病中的表達及臨床意義

馮嘉昆 綜述 李正發 審校

1.昆明理工大學醫學院，云南 昆明 650504；2.昆明理工大學附屬醫院/云南省第一人民醫院，云南 昆明 650032

慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是骨髓造血干細胞惡性克隆性增生形成的血液系統腫瘤，90%以上CML 患者t(9；22)(q34；q11)易位形成BCR-ABL 融合基因為主要發病特征。其BCR-ABL 融合基因表達的致癌性蛋白(p210)具有酪氨酸激酶活性，該激酶活性改變了細胞內正常的信號通路傳導，并抑制了細胞凋亡的發生。一代酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(imatinib，mesylate，IM)能靶向抑制p210酪氨酸激酶活性，是治療CML的首選藥物[1]。然而隨著酪氨酸激酶抑制劑問世，其盡管療效令人滿意但仍有20%的患者用藥后出現不敏感及耐藥情況，分別稱為原發性耐藥或獲得性耐藥。此外，少數患者對IM不耐受，表現為嘔吐、肌無力、血細胞減少[2]。近年來研究發現，在CML 患者BCR-ABL 融合基因陽性的骨髓樣本中發現PML高表達，提示TKI耐藥的白血病細胞是導致疾病耐藥、復發的關鍵因素且PML可能與白血病耐藥或急變有密切關系[3]。本文就PML 在CML細胞中的表達意義進行綜述。

1 PML 基因

PML 基因最早在急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)中被發現，因染色體特征性的t(15，17)易位形成了PML-RARα融合基因，從而造成造血干/祖細胞在早幼粒細胞階段分化受阻而獲得自我更新的能力，成為APL發病主要機制[4]。該基因全長53 Kb，位于第15號染色體上，C末端外顯子通過可變剪接后形成六種核型結構和一種胞質型結構[5]。其中，一種定位于核基質的多蛋白復合體稱為PML 核體(PML-NBs)[6]，具有促細胞凋亡、抑制腫瘤發生等生物學功能。N 末端418 個氨基酸是所有同種型共有序列，包含RING(R)、B-Boxl(B1)、B-Boxl(B2)和卷曲螺旋(CC)結構域，總稱為RBCC 或三聯基序(TRIM)結構域[7-8]。超過120 種蛋白質與PML 相互作用介導了PML 在細胞中的生命活動，如BCL-2、UBC、STAT3等[9]。由于PML核體具有多種生物學功能成為生命科學研究領域的熱點，但目前國內外的研究主要集中于PML核體在實體瘤的發生及治療中的新發現，而在非APL髓系白血病的研究相對較少。

2 PML在造血干細胞以及慢性髓系白血病的調節作用

2.1 PML 在造血干細胞中的調節作用 與磷酸酶和張力素同源酶(PTEN)類似，PML通過多種水平負調控PI3K/AKT/mTOR信號通路，其中PML-NBs 募集AKT 磷酸酶PP2a 和磷酸化AKT 后共定位于核內，使磷酸化AKT失活從而達到抑癌作用。ITO等[3]研究發現，PML 高表達于造血干細胞中，但其與造血干細胞分化程度呈負相關。敲除后的PML-/-小鼠骨髓中的造血干細胞數顯著少于野生型小鼠，提示PML可能與造血干細胞增殖有著密切聯系。

2.2 PML在慢性髓系白血病中的表達與作用 ITO等[3]，基于PML 對造血干細胞維持具有關鍵作用的這一假設成立，深入研究發現在80 例CML 患者慢性期標本中PML 基因表達水平較高；且與低表達患者相比，低表達患者分子遺傳學緩解率更優預示著臨床療效更佳；提示PML可能與CML發展、患者預后有著緊密聯系。在對CML疾病模型分析時也支持這一觀點，敲除PML 后的白血病干細胞(leukemia stem cells，LICs)克隆形成能力降低，最終消耗殆盡。CML 白血病細胞可能通過PML-PTEN 信號通路維持細胞存活。PTEN 是最常見的腫瘤抑制因子之一[10-11]，PTEN通常定位于細胞核和胞漿中，在細胞核內定位的能力對于維持基因組的穩定性和抑制生長是必不可少的。相關研究指出，在許多癌癥標本中PTEN 核定位是經常性丟失的[12]。腫瘤抑制因子PTEN受皰疹病毒相關泛素特異性蛋白酶(HAUSP 或稱USP7)的負調控，而HAUSP具有調節p53的抑癌功能。SONG等[13]研究報道，PTEN核質穿梭受到HAUSP的去泛素化調控。HAUSP 使PTEN 去泛素化，HAUSP 則受到PML負調控[14]。MOROTTI等[15]在對BCR-ABL陽性的造血祖母細胞研究中發現，PML低水平表達時，HAUSP活性增高并使PTEN 去泛素化，PTEN 發生核排斥，使造血祖母細胞增殖。且指出BCR-ABL是直接通過酪氨酸激酶活性使HAUSP 磷酸化，導致PTEN 的核排斥，CML造血祖細胞獲得異常增殖優勢。在對CML干細胞的研究中發現高表達的PML 抵消了BCR-ABL 對PTEN 的核排斥作用，致使PTEN 在細胞核中積累，最終維持CML干細胞靜止狀態，這種狀態維持白血病細胞產生耐藥性是所必須的。應用AS2O3聯合IM 處理CML 干細胞后PML 降解，促使CML 干細胞對IM 敏感?？傊?，PML 介導HAUSP 負調控，支持PTEN 核定位，BCR-ABL 則與PML 功能相反，以促進PTEN 核排斥(圖1)。

圖1 PML-PTEN信號通路圖

最新研究報道，骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的PML 調節其促炎因子對于維持CML細胞增殖具有一定作用[16-18]。GUARNERIO等[19]將BCR-ABL 陽 性 的CML 與MSCs (PML-/-)、MSCs(PML+/+)體外共培養時，發現當與MSCs(PML+/+)共培養時白血病細胞數量有明顯增多。提示MSCs(PML+/+)可能具有維持白血病細胞作用。后經AS2O3處理的CML 細胞與MSCs(PML+/+)共培養，發現白血病細胞與未處理組比較數量明顯減少。其次PML 調控趨化因子CXCL1和IL-6在白血病的發展過程中也起著重要的作用。在白血病患者血清樣本中發現CXCL1和IL-6水平高于對照組，提示將這兩種細胞因子作為其他細胞因子或其受體的靶點，可能與聯合常規化療治療的白血病患者帶來良好預后[20]。該研究提示，在CML 中，BCR/ABL 控制IL-6 的表達，并通過IL-6建立旁分泌環，進而維持白血病細胞。但PML的靶向降解或選擇性抑制PML誘導的因子(如：IL-6)，是否有助于根除CML的微小殘留病灶，以及是否可能通過增高IL-6水平使細胞凋亡途徑受限，使白血病細胞維持靜止態，還需進一步研究驗證。

臨床研究中，發現一例78 歲男性患者初診為CML 經服IM6 個月后因頭昏及易疲勞遂改服達沙替尼(二代酪氨酸酶抑制劑)。由于患者無定期隨訪史，7年后復查報告顯示原始細胞占2%、早幼粒細胞占18%，應用熒光原位雜交分析發現BCR-ABL融合蛋白(P210)與PML-RARα融合蛋白拷貝數相當，分別為48.25 和46.44，已達中度風險的APL 診斷標準。隨后給予維甲酸和AS2O3治療，復查融合蛋白轉錄水平，發現BCR-ABL 融合蛋白(p210)和PML-RARα表達水平明顯減少[21]。該研究提示，PML 在IM 治療的CML 患者中可能伴隨疾病發展。雖然這類病例目前少有報道，但隨著酪氨酸激酶抑制劑與化療藥物的使用，CML 患者繼而發生耐藥情況。耐藥白血病細胞可能通過PML介導的信號通路維持生存，但調控分子機制尚未完全了解。

3 針對PML治療對策探索

3.1 砷劑治療PML-RARα(+)APL、CML 砷在傳統中醫用藥已有兩千多年的歷史，我國研究人員最初使用AS2O3和氯化汞溶液治療急性和慢性白血病患者，隨后報道了APL患者成功治愈，并指出使用AS2O3對APL 細胞呈劑量依賴性?？茖W家們進一步深入研究證明[22]，砷的治療效果是由于其對融合蛋白PML-RARα中的PML 部分起作用，砷與PML 蛋白B2結構域中的兩個半胱氨酸殘基結合，誘導氧化導致二硫鍵形成，并使PML發生小泛素化相關修飾(SUMO)，并引起環指蛋白4 (RNF4，是一種泛素連接酶)聚集，最后形成的泛素化PML-RARα復合物將通過泛素-蛋白酶體途徑被降解[23-24]。針對CML確診治療后，建議定期監測PML-RARα融合。發生PML-RARα融合的患者，治療上采取全反式維甲酸和AS2O3可達到形態學緩解[21]。隨著藥物靶向抑制癌基因的發展，AS2O3消除腫瘤細胞受到廣泛青睞。但據報道，AS2O3的毒副作用較大可引起白血病患者骨髓抑制、肝功能障礙、胃腸紊亂以及對心臟等的毒副作用[25-28]。

3.2 藥用植物活性成分誘導PML-RARα(+)APL細胞凋亡的研究進展 MALIHEH等[29]利用西紅花素誘導急性APL 細胞凋亡，發現西紅花素能使PML-RARα融合基因表達下調，并通過BAX/BCL2途徑使白血病細胞發生凋亡。鄧守恒等[30]研究提示，硒化殼聚糖處理NB4 細胞時降低PML-RARα融合蛋白含量并抑制細胞增殖。陳銘陽等[31]在對龜甲中潛在藥理活性的miRNA 研究中通過靶基因預測結果顯示一條取名為xtr-miR-22的miRNA可作用于PML基因的表達，預示著其潛在治療早幼粒細胞白血病的藥理活性。吳迪炯等[32]利用苦參堿聯合全反式維甲酸處理耐藥的NB4細胞時，發現細胞獲得再分化的能力，同時降低PML-RARα融合蛋白的含量。朱紅青等[33]研究發現利用葛根總黃酮體外能誘導早幼粒細胞白血病細胞株NB4 凋亡。楊雷等[34]利用丹參酮ⅡA 治療耐AS2O3和全反式維甲酸治療APL，白血病患者使用丹參酮ⅡA治療后骨髓形態學達到完全緩解；此外，丹參酮ⅡA還能促進CML細胞凋亡[35]。綜上，中藥活性成分作為當前腫瘤治療的重要途徑之一。大量藥理學研究證明，其具有多成分、多靶點干預、副作用低等優勢，但中藥針對PML靶基因抑制的開發具有潛在巨大價值。

4 結語

PML在DNA損傷反應、細胞凋亡、衰老和血管生成等執行著多種生物學功能。進一步研究表明，PML在CML 細胞維持中具有重要意義；PML 可能通過PML-PTEN 通路介導腫瘤細胞生存。盡管經IM 治療的CML患者出現PML-RARα融合及早幼粒細胞爆發現象比較罕見，但這種現象是因IM治療后獲得還是伴隨CML疾病發展出現，尚未見相關文獻報道。新的治療方法可能針對PML，用以靶向下調PML表達或使腫瘤干細胞消耗殆盡。無論是在正常還是病理條件下，進一步研究PML及其相關通路都可能提供更多的藥物靶點，并將有助于治療慢性髓系白血病開辟新道路。

早期藥理研究中指出利用AS2O促成PML蛋白降解，但據相關報道分別指出AS2O3造成機體肝臟、心臟損害的毒性是不可忽略的，因此尋找新藥代替AS2O3或聯合化療藥物、酪氨酸抑制劑使用靶向下調PML 基因的表達是必要的。部分研究已證明中藥活性有效成分可抑制PML-RARα融合基因/蛋白的表達[36-37]，但是否通過靶向作用于PML 基因及其作用機制則需通過實驗進一步證明。隨著中醫理論與血液腫瘤的關系不斷的深入，通過中醫藥手段來降低患者的放化療毒副作用及復發率，提高腫瘤患者的生存率，具有廣闊的臨床應用前景。