miR-217在hADSCs增殖與成骨分化中的作用及其機制研究

韋宗勇，肖展宏，黎裕明

南寧市第一人民醫院康復醫學科1、骨科2，廣西 南寧 530001

骨骼為支撐人體運動的主要結構，在日常生活中易因創傷而骨折，骨缺損、骨折愈合不良是臨床一大難題。組織工程成骨分化為臨床骨組織需求帶來了希望之光，種子細胞如人脂肪組織源性間充質干細胞(hADSCs)是組織工程成骨分化的核心和重點[1]。hADSCs 身體儲量豐富、來源廣泛、容易獲得、低免疫原性、培養便捷、性能穩定、分化潛能好[2]。然而目前hADSCs 定向成骨分化能力仍未達到臨床標準，因而制約了其臨床應用。諸多研究顯示miRNAs參與了人體多種生理、病理過程，包括調控干細胞向成骨細胞分化[3]。miR-217 在多種細胞系中發揮了不同的生理功能，本課題主要檢測miR-217 在調控hADSCs 成骨分化中發揮的作用機制，以期能為優化hADSCs 定向成骨分化的組織工程化骨提供相關數據。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 培養基、胎牛血清、雙抗購自Gibco；Dexamethasone、β-glycerophosphate、Vitamin-C購自Sigma公司；Trizol試劑盒(Invitrogen)、PCR試劑盒(Applied Biosystems)，Lipo 3000 (Invitrogen)，miR-217 mimic、miR-217 inhibitor和對照購自上海吉凱。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs分離培養 依據既往研究報道[4]，經過倫理委員會批準，和經得本人簽署知情同意書，獲取人體脂肪組織并分離hADSCs，培養于10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養基中，取第三代細胞用于后續研究。

1.2.2 hADSCs 成骨誘導 將不同分組的hADSCs 接種于6 孔板、每組3 個復孔，待細部貼壁后進行誘導成骨分化，進行誘導成骨分化，誘導培養基的組成成分包括10%FBS、0.1 μmol/L Dexamethasone、10 mmol/L β-glycerophosphate和50 mg/L Vitamin-C。

1.2.3 細胞轉染 依據說明書進行操作，將miR-217 模擬物和miR-control、miR-217 抑制劑和對照物轉染至hADSCs，24 h 后更換培養基。hADSCs細胞生長融合度達到約70%時采用成骨誘導培養基、進行誘導分化。

1.2.4 qPCR 反應 提取總RNA，逆轉錄cDNA，進行qRT-PCR。其反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環。隨后以GAPDH 為內參、采用2-ΔΔCt法計算各個基因相對表達量。miRNA 擴增以BioTNT 的miRNA 定量PCR試劑盒操作，U6 作為內參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 茜素紅染色 成骨分化誘導14 d，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 次，95%乙醇固定10 min，雙蒸水洗3 次，配制pH 8.3 的0.1%ARS-Tris-Hcl 染料，37℃反應1 h，光學顯微鏡下觀察染色情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件分析數據，所有計量資料符合正態分布，以均數±標準差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hADSCs生長曲線 倒置相差顯微鏡下顯示第三代hADSCs 呈梭形、束狀或者紡錘形的細胞狀排列，細胞核位于中央、細胞輪廓清晰、體外附著于細胞培養瓶上的一定底物而生長(圖1)。CCK8 檢測顯示hADSCs 細胞生長曲線呈現S 形，3～6 d 為細胞對數生長期，6 d達高峰后隨后逐漸降低進入平臺期。

2.2 miR-217在hADSCs 成骨分化中高表達 為了檢測hADSCs成骨分化過程中參與的microRNA，分別于0 d及21 d收集誘導分化的細胞、提取總RNA，基因芯片顯示此過程中多個microRNA 表達上調，其中miR-412-5p、miR-19a-3p 、miR-217 升高趨勢最明顯。隨后提取0 d、7 d、14 d及21 d誘導分化細胞的總RNA，采用qRT-PCR 檢測顯示隨著hADSCs 成骨誘導時間延長，miR-412-5p、miR-19a-3p 、miR-217 表達都逐漸升高、每個時間點與誘導前比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，其中miR-217升高最顯著，因此本研究選擇miR-217作為后續研究，見圖2。

圖1 第3代hADSCs形態及生長曲線

2.3 miR-217調控hADSCs增殖 應用12.5 nmol/L、25 nmol/L 及50 nmol/L 濃度的上述質粒[miR-217 模擬物(miR-217 mimics)和miR-control、miR-217 抑制劑(miR-217 inhibitors)和anti-miR-control]轉染hADSCs，qRT-PCR 結果顯示miR-217 mimics 和inhibitors分別顯著促進或抑制miR-217表達，效果體現出濃度劑量依賴性，組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。后續試驗采用50 nmol/L 濃度的miR-217 模擬物或抑制劑。

圖2 microRNA在hADSCs成骨分化過程中表達情況

為了驗證miR-217 對hADSCs 增殖的調控，hADSCs 分 為 四 組(miR-217 mimics 和miR-control、miR-217 inhibitors 和anti-miR-control)，處理0 d、1 d、2 d、3 d 和4 d后中斷反應，CCK8 檢測發現miR-217 mimics 促 進hADSCs 增 殖，miR-217 inhibitors 抑 制hADSCs增殖，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

2.4 miR-217 促進hADSCs 成骨分化 為探討miR-217 調節hADSCs 成骨分化的效果，實驗細胞按照上述分組，誘導7 d 后提取總RNA。RT-PCR 結果顯示，miR-217 mimics 能促進hADSCs 內成骨相關基因ALP (堿性磷酸酶)、OCN (骨鈣蛋白)、Runx2(Runt 相關轉錄因子2)、Osterix (成骨細胞特異轉錄因子)mRNA 的表達，miR-217 inhibitors 則抑制上述基因表達，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖3 RT-PCR檢測各濃度轉染組miR-217的相對表達量

圖4 CCK8 檢測發現miR-217 mimics 促進hADSCs 增殖，miR-217 inhibitors能夠抑制hADSCs增殖

茜素紅染色顯示miR-217 mimics 處理并成骨誘導7 d 后的hADSCs細胞茜素紅染色陽性明顯增強，轉染miR-217 inhibitors 后細胞茜素紅染色陽性顯著減弱，提示過表達miR-217 可增強hADSCs 的成骨鈣沉積活性，見圖6。

圖5 miR-217 mimics和miR-217 inhibitors對成骨相關基因表達的調控注：RT-PCR顯示miR-217 mimics能促進ALP(A)、OCN(B)、Runx2(C)、Osterix(D)mRNA表達，miR-217 inhibitors抑制上述基因表達；aP＜0.05。

圖6 miR-217 調控hADSCs成骨分化的茜素紅染色結果(×20)

3 討論

骨骼為支撐人體運動的主要結構，日常生活中易因創傷而骨折，骨缺損、骨折愈合不良是臨床一大難題。組織工程成骨為臨床骨組織需求帶來希望，種子細胞是組織工程的重點，hADSCs身體儲量豐富、來源廣泛、獲取容易、免疫原性低、培養便捷、性能穩定、分化潛能好，因而是首選種子細胞。然而目前hADSCs定向成骨分化能力仍未達到臨床標準，因而制約了其臨床應用，外源性干預有助于提高hADSCs 成骨分化效率，因而值得進一步研究。

microRNA(miRNA，微小RNA)是近年來逐漸引起廣泛關注和重視的、在真核生物中發現的一類5'端帶磷酸基團、3'端帶22 nt左右長度羥基的內源性非編碼調控RNA。成熟的miRNAs 是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶剪切加工而產生，隨后組裝進RNA成為誘導沉默復合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA 或者阻遏靶mRNA 的翻譯。miRNA的主要功能為調節內源基因表達，參與細胞周期調控及個體發育進程。研究顯示miRNAs參與了多種細胞生物行為學功能、發揮了極其重要的作用，如miRNAs調控間充質干細胞的增殖、凋亡和向成骨細胞分化[5]。既往研究顯示miR-384-5p通過調控下游靶基因Gli2、從而達到抑制BMSCs 細胞的成骨分化[6]；SIRT1 通過miR-132-3p 調控MC3T3-E1 細胞成骨分化，SIRT1 過表達能夠促進細胞MC3T3-E1 增殖和成骨分化[7]；miR-124 可以通過靶基因Sp7 來調節BMSCs 細胞的成骨分化，miR 124 mimics 能夠顯著上調BMSCs 細胞內成骨相關基因ALP和osteocalcin表達[8]；CHEN等[9]通過活體和離體實驗發現過表達miR-375 促進hADSCs成骨分化，并且證實miR-375是通過靶基因YAP1和YAP1/DEPTOR/AKT 網絡來調控hADSCs 成骨分化。miR-217的相關研究已經有諸多報道，miR-217通過靶基因SIRT1抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲[10]；miR-217 通過抑制靶基因TLR5 表達從而緩解神經病理學疼痛[11]；miR-217 通過抑制靶基因DKK1 促進BMSCs 細胞增殖和成骨分化[12]。miRNA 對hADSCs成骨分化的研究也有相關報道，然而現在尚無關鍵性進展，亦無臨床應用。

本研究通過分離并離體培養hADSCs、誘導其成骨分化，采用CCK8 及qRT-PCR 等方法檢測miR-217對hADSCs 成骨分化的調控作用。結果發現隨著hADSCs 成骨分化進程的進展，miR-217 表達呈上升趨勢，推測miR-217 可以正向調控hADSCs 成骨分化。隨后采用miR-217 mimics 和miR-217 inhibitors分別過表達和抑制hADSCs 細胞中miR-217 的表達，同時檢測hADSCs 成骨分化的進程。結果發現miR-217 模擬物能促進hADSCs 內成骨相關基因Osterix、OCN、Runx2、ALP mRNA 的表達，miR-217 抑制劑則可以抑制上述成骨相關基因表。同時為直觀觀察hADSCs 成骨分化的礦化結節，我們采用茜素紅染色檢測hADSCs 是否已經成功向成骨細胞分化，結果顯示miR-217 mimics 轉染顯著增強了hADSCs 細胞茜素紅染色陽性；提示miR-217 對hADSCs 成骨分化起著正向調控作用。

綜上所述，本研究系統性地研究miR-217對hADSCs 細胞增殖和成骨細胞分化的影響作用，我們發現miR-217 可以正向促進hADSCs 內成骨相關基因Osterix、OCN、Runx2、ALP 的表達，提示過表達miR-217可以正向促進hADSCs成骨分化的進程。