不同連栽代數杉木人工林土壤真菌群落結構及多樣性分析

嚴紹裕，傅成杰，余燕華，錢葉會

（福建林業職業技術學院，福建 南平 353000）

森林土壤微生物主要包括土壤細菌和土壤真菌，而真菌作為真核生物的群體之一，分擔著分解枯落物的角色、扮演著“微生物-土壤-植被”相互作用中的傳遞者[1]。森林土壤真菌是森林生態環境的重要成員，一方面積極參與森林土壤的物質分解、養分轉化及能量交換等，為植物發育提供營養物質；另一方面，有毒真菌群落通過土壤侵入植物，對植物的生長產生危害[2-3]。森林生態環境受土壤真菌數量與土壤真菌群落結構多樣性的影響，土壤真菌的數量不但直接影響森林土壤的化學活性及森林土壤養分的構成與轉變，而且也是森林土壤活力的具體體現，是林地生產力保持與修復的主要動力之一[4]，對林業的發展與生產起著關鍵的作用。森林環境的養分、植物種類組成與土壤真菌群落結構與多樣性互相影響，研究土壤真菌的數量與土壤真菌結構的多樣性是屬于從上層揭示森林生態環境的能量流動與物質循環[5]。但是森林生態環境的復雜性間接導致土壤真菌數量的豐富性、土壤真菌群落的復雜性、直接觀察土壤真菌的困難性[6]。最原始的研究方法是通過配制不同的真菌培養液對土壤真菌的單純培養，再依據培養真菌的形態差異進行分類與鑒別，最后得到土壤樣品中真菌的數量與土壤真菌群落結構的信息[7]。研究者對土壤真菌的研究逐漸深化，需要更深入獲得更深層次的信息，因而對研究土壤微生物技術有了更高的要求，引起了高通量測序技術的快速發展，這就為分析真菌的數量與種類、真菌群落結構的多樣性提供更加全面準確的方法[8]。本研究旨在揭示不同代數杉木林土壤中真菌的數量與真菌群落結構的多樣性，為杉木人工林連栽地的土壤修復提供理論基礎。

杉木[Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.]是我國南方最重要的用材樹種之一[9]。長期以來的研究表明，杉木人工林傳統種植方式如煉山、整地、純林種植以及連栽等會導致林分養分流失大而歸還速度比較慢、林分生物多樣性下降、有毒物質積累等，從而影響了杉木人工林林地的可持續經營[10-12]。杉木人工林土壤活力的降低改變了土壤的物理與化學性質、土壤的真菌數量、真菌群落多樣性。以往有關杉木連栽的研究主要集中在連栽對杉木人工林生長及生理活性變化、土壤理化性質的改變等，而關于不同連栽代數杉木林的土壤真菌數量與真菌群落多樣性的研究報道較少。鑒于此，本論文以杉木一代林（FCF）、連栽二代林（SCF）及連栽三代林（TCF）為研究對象，采用高通量測序技術，分析不同連栽代數杉木人工林土壤真菌的數量與種類、真菌群落多樣性，并進一步分析真菌群落多樣性及其和環境因素的相關關系，從理論上探明杉木連栽對土壤真菌群落結構多樣性的影響，為杉木人工林高效培育奠定理論參考依據。

1 試驗地概況

試驗樣地設于福建省南平王臺鎮溪后村，平均海拔200 m，年平均氣溫19.3℃，年平均降雨量1 969 mm，屬于亞熱帶季風氣候，土壤為紅壤，土層深度100 cm以上，具體林分情況見表1。杉木一代林（FCF）林下灌木層主要有杜莖山 （Maesa japonica）、寒刺泡（Rubus buergeri）、粗葉榕（Ficus hirta），草本層以觀音蓮座蕨（Angiopteris fokiensis Hieron）、水龍骨（Rhizoma polypodiodis）、金毛狗（Cibotium barometz）為主。連栽二代林（SCF）與FCF的水平相距為500 m，林下灌木層以絨毛山胡椒（Lindera nacusua）、寒刺泡為主，草本層以腺毛金星蕨 （Thelypteris glanduligera）、毛柄短腸蕨（Athyrium iseanum）、金毛狗為主。連栽三代林（TCF）與FCF的水平相距為1.3 km，林下灌木層以絨毛山胡椒、粗葉榕為主，草本層以鐵芒萁（Dicranopteris linearis）、金狗脊為主。

表1 林分基本特征Tab.1 Characteristic of sample area

2 材料與方法

2.1 土壤采集

2018年7月底在不同連栽代數林分中分別設置3塊20 m×20 m樣地進行林分調查。每個樣地采用“梅花”形取樣法[13]分5個點分別采集0～10 cm土層土壤，取樣后將每塊樣地的土壤樣品混勻后，用四分法保留500 g左右，去除動植物物殘體和石子后過2 mm篩，用無菌塑封袋裝土壤樣品立即放于4℃冰盒保存帶回實驗室。取回的土壤樣品分成常溫保存、-80℃低溫保存[14]。

2.2 土壤樣品的測定方法

采用光譜分析法測定土壤的含水率[15]；參照國標測定土壤的物理性質、pH值、全磷、全鉀[16]；土壤全碳和全氮含量采用近紅外光譜分析法測定[17]。

2.3 數據處理

2.3.1 物種分類與豐度分析

OTU即分類操作單元，為了進行方便研究，設定一個分類的單元。利用QIIME軟件[18]中的UCLUST[19]對Tags進行聚類分析、獲得分類操作單元，對分類操作單元進行分類學的注釋是基于Silva分類學數據庫，即可得到各分類學水平下物種的組成及相對豐度。

2.3.2 Alpha多樣性統計分析

對土樣的Alpha多樣性指數的評估使用Mothur軟件進行分析。為比較樣品間的Alpha多樣性指數，在97%相似度水平下，分析時先進行樣品間的序列數進行標準化。計算群落Chao1指數[20]、Ace指數[21]、Shannon指數[22]、Simpson指數[23]。

2.3.3 統計分析

利用Excel 2010計算實驗數據的平均值和標準偏差。Pearson相關性分析使用SPSS 20.0軟件[24]，利用CANOCO 5軟件完成不同代數杉木林土壤真菌種類與環境因子影響的分析[25]。

3 結果與分析

3.1 不同連栽代數杉木人工林土壤真菌種類分析

通過高通量測序得到不同連栽代數杉木人工林土壤主要真菌門類包括子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、Rozellomycota門等（圖1），真菌群落結構的相對豐度的分布在不同代數杉木林的土壤中存在差異。子囊菌門為FCF、SCF、TCF的真菌優勢菌門，不同代數杉木林土壤中子囊菌門相對豐度的高低順序為SCF＞FCF＞TCF，其中SCF與TCF之間相對豐度具有顯著差異，SCF和FCF之間不具有顯著差異；不同代數杉木林土壤中擔子菌門相對豐度的高低順序為FCF＞SCF＞TCF，表明隨著連載代數的增加，擔子菌門在杉木林土壤中的相對豐度逐漸降低；不同代數杉木林土壤中接合菌門相對豐度為，FCF的相對豐度最高，其次為TCF，SCF的相對豐度最低，FCF與TCF之間接合菌門相對豐度差異不顯著，而SCF接合菌門相對豐度則顯著高于FCF、TCF。

圖1 不同連栽代數杉木人工林土壤真菌群落結構相對豐度Fig.1 Relative abundant of soil fungi community structure in different planting generations of Chinese fir plantation

3.2 不同連栽代數杉木林土壤真菌群落結構多樣性分析

通過對不同代數杉木林真菌群落多樣性指數分析(如圖2)，不同代數杉木林中群落多樣性指數Ace為FCF最高，其次為SCF，最低為TCF，并且FCF和SCF多樣性指數Ace顯著高于TCF；不同代數杉木林中群落指數Chao1由小到大為TCF＜FCF＜SCF，且三種林分之間均具有顯著差異；不同代數杉木林中群落多樣性指數Simpson由大到小的順序為TCF＞FCF＞SCF，且三種林分之間均具有顯著差異；不同代數杉木林中群落多樣性指數Shannon的大小順序為FCF＞SCF＞TCF，并且FCF和SCF Shannon指數顯著高于TCF。土壤真菌群落的物種豐度、物種均勻度會影響Shannon指數、Simpson指數，若物種豐度相同，群落中均勻度大的物種，則認為該群落的多樣性越豐富。Ace指數、Chao1指數、Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，說明土樣的物種多樣性越大[26]。不同林分中FCF的群落Ace指數、Chao1指數、Shannon指數均為最大，而Simpson指數最小，說明FCF真菌數量豐富；不同代數杉木人工林中TCF的群落Ace指數、Chao1指數、Shannon指數均為最小，而Simpson指數最大，說明TCF真菌數量在減少。不同代數杉木林中真菌群落多樣性大小順序為FCF＞SCF＞TCF，即一代杉木林中的群落多樣性最高，由此可得隨著杉木林連植代數的增加群落多樣性逐漸降低。不同代數杉木林中OUT的大小順序為FCF＞SCF＞TCF，而FCF與SCF之間沒有明顯的差異；不同代數杉木林中從Coverage看，FCF的覆蓋度最高，并且不同林分的Coverage值在0.85以上，能夠反映出土壤中真菌群落比較豐富。

圖2 不同連栽代數杉木人工林土壤真菌群落多樣性指數Fig 2 Soil fungi community diversity index in different planting generations of Chinese fir plantation

3.3 不同代數杉木林土壤真菌類群與環境因子的關系分析

森林擁有一個復雜的生態環境，而森林環境中的植物群落、氣候條件等都對土壤真菌的群落活動產生影響[27]，反之土壤真菌的群落活動也會對森林土壤的理化性質產生影響。

由圖（3A）得到土壤容重、土壤含水率等對優勢真菌的數量有較大影響。其中，土壤容重與子囊菌門、擔子菌門、接合菌門存在負相關關系；土壤含水率與擔子菌門、接合菌門呈現正相關的影響，與子囊菌門呈現負相關的影響。由此說明不同代數杉木林的土壤真菌群落與其土壤物理性質存在一定相互作用。

由圖（3B）得到全磷、全碳、pH對真菌群落分布存在一定的影響。全磷與子囊菌門、擔子菌門、接合菌門呈現負相關的影響；土壤pH影響土壤化學性質等控制真菌的生物數量，而使土壤群落組成、多樣性受到干擾。全碳、pH與子囊菌門、擔子菌門、接合菌門存在正相關的關系；由此說明不同代數杉木林的土壤真菌群落與其土壤化學性質存在一定的相互影響關系。

圖3 不同連栽代數杉木人工林土壤真菌門類與土壤物理化學性質RDA排序圖Fig.3 The ordination diagram of RDA about soil fungi phylum and dominant order with environmental factors in different planting generations of Chinese fir plantation

4 結論

森林土壤中微生物主要包含了土壤真菌與細菌，在生態環境中起著關鍵的作用，并與其他成員共同推動著陸地生態系統中的能量流動、信息交換、物質循環[28]。森林真菌群落的生物多樣性與森林生態環境的結構與組成息息相關，是保持土壤活力的關鍵部分[29]。本研究通過運用高通量測序法研究了不同代數杉木林的土壤真菌的種類與數量以及結構多樣性，結果表明不同代數杉木林土壤的主要真菌優勢門類包括子囊菌門、擔子菌門、接合菌門。不同代數杉木林土壤中子囊菌門相對豐度的高低順序為SCF＞FCF＞TCF；不同代數杉木林土壤中擔子菌門相對豐度的高低順序為FCF＞SCF＞TCF；不同代數杉木林土壤中接合菌門的相對豐度為FCF的相對豐度最高，其次為TCF，SCF的相對豐度最低。表明隨著連植代數的增加，真菌優勢門類的總體趨勢表現為在杉木林土壤中的相對豐度逐漸降低。

采用多個指標評價不同代數杉木林土壤真菌數量與群落結構的多樣性，結果表明不同代數杉木林中真菌群落多樣性豐富度大小順序為FCF＞SCF＞TCF，即一代杉木林的群落多樣性豐富度最高，由此可得隨著杉木林連植代數的增加群落多樣性豐富度逐漸降低。不同代數杉木林中OUT的大小順序為FCF＞SCF＞TCF；不同代數杉木林中從Coverage看，FCF的覆蓋度最高，并且不同林分的Coverage值在0.85以上，能夠反映出土壤中真菌群落比較豐富。由此說明了連植導致了杉木林土壤真菌群落結構與多樣性發生了變化。

森林擁有一個復雜的生態環境，生活在這個復雜環境中的真菌群落受森林環境中的氣候、溫度、各種養分變化的影響；而真菌群落結構的多樣性也會影響森林環境的養分結構、植物種類等。從物理性質與真菌優勢門類的RDA分析得到土壤容重與子囊菌門、擔子菌門、接合菌門存在負相關關系；土壤含水率與擔子菌門、接合菌門呈現正相關的影響，與子囊菌門呈現負相關的影響。由此說明不同代數杉木林的土壤真菌群落與其土壤物理性質存在相互作用的關系。從化學性質與真菌優勢門類的RDA分析得到全磷與子囊菌門、擔子菌門、接合菌門呈現負相關的影響；土壤pH影響土壤化學性質等控制真菌的生物數量，而使土壤群落組成、多樣性受到干擾。全碳、pH值與子囊菌門、擔子菌門、接合菌門存在正相關的關系；由此說明不同代數杉木林的土壤真菌群落與其土壤化學性質存在一定的相互影響關系。不同代數杉木林的土壤真菌群落的多樣性受到土壤物理化學性質不同程度的影響，可能是由于森林環境的發生了變化，而土壤真菌群落對于這樣的變化特別敏感，由此出現真菌群落聚集與單一化的現象。

隨著杉木林的連栽代數的變化，不同代數杉木林中土壤真菌群落在空間上呈現不同變化規律，并且隨著杉木林的連栽，真菌群落多樣性出現一定的差異變化。森林環境中的植被類型決定了土壤真菌的群落結構，土壤真菌的群落結構又影響著森林環境，由此出現真菌群落與森林環境相互作用的結果。在這個復雜的森林環境中“微生物-土壤-植被”又存在著復雜相關關系[30]。