血清microRNA-200c在原發性腎病綜合征中的表達及臨床意義分析

萬 菁 白 微 陳 紅 奚經巧 郭躍麗

（浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院檢驗科，浙江 溫州 325000）

原發性腎病綜合征（primary nephrtic syndrome，PNS）是臨床常見的一組腎臟疾病綜合征。腎病綜合征已成為臨床上最常見的腎小球疾病，其發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。目前，原發性腎病綜合征的診斷和預后預測主要依靠血和尿生化檢測（如尿蛋白、血人血白蛋白、血脂水平和尿量等）和創傷性檢查（如腎臟穿刺活檢）。然而，尚缺乏理想的生物標志物用于原發性腎病綜合征的診斷和用于激素治療效果和預后預測[3]。近年來，miRNA（MicroRNA）作為疾病的新分子標志物得到學者們的廣泛關注，然而，microRNA在腎病綜合征的應用研究仍處于起步階段[4-5]。因此，本研究擬探索原發性腎病綜合征患者血清microRNA-200c的表達水平變化情況，并探討其臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象：采用嚴格篩選、遵循自愿原則，選取在本院首診并診斷為原發性腎病綜合征的160例患者作為病例組研究對象；同時，按照1∶1 匹配的方法另選取160名同期健康體檢人員為對照組，對照組匹配的主要要求：年齡相差＜2歲、性別一致、民族一樣、經濟收入相當、職業相當、居住條件相當。

1.2 資料收集方法：收集所有患者和對照組的病史，檢測患者和對照組血液和尿液標本，檢測他們的血常規、尿常規和血液相關生化指標。所有研究方案均通過溫州市中醫院倫理委員會批準，并按照Helsinki國際宣言，在原發性腎病綜合征研究中，告知參與者本研究的內容及意義，在完全志愿的基礎上簽署知情同意書后收集。

1.3 診斷標準：依據人民衛生出版社出版的《內科學》中關于原發性腎病綜合征的診斷標準：大量蛋白尿，24 h尿蛋白含量超過3.5 g/L，血漿白蛋白＜30 g/L，膽固醇＞5.7 mmol/L，并且伴有不同程度水腫。

1.4 納入和排除標準：所有入選患者均經臨床確診，并符合原發性腎病綜合征診斷標準，近期內未服用激素等藥物進行治療。排除標準：排除繼發性腎病綜合征患者，排除合并心臟病、腫瘤以及嚴重肝功能異常者以及有精神類和神經病史患者。

1.5 標本采集及檢測：所有患者的血清和尿液樣本均在首診后未接受治療前采集，處理過程嚴格按照如下步驟進行：收集原發性腎病綜合征患者和正常對照的全血及尿液樣本。收集的血清和尿液樣本在室溫下3000 g離心10 min去除細胞并收集上清，然后將收集的上清在4 ℃條件下，12000 g離心5 min，進一步去除殘留的細胞，離心后收集上清置于干凈的Eppendoff管中-80 ℃保存待用。另外，所有研究對象測定血尿常規、血漿總蛋白、白蛋白、血肌酐、尿素氮和血漿膽固醇和三酰甘油及24 h尿蛋白定量和病理亞型等指標。

1.6 試劑：Trizol試劑（美國Invitmgen），miRNeasy mini kit（美國QIAGEN公司）；miRNA-200c及U6引物試劑盒（上海生工）。

1.7 血清RNA提取：常溫下解凍樣本，取血清樣本100 μL血清按Trizol試劑和miRNeasy mini kit說明書提取總RNA。外光分光光度計（NanoDrop 2000）進行血漿總RNA濃度和純度的鑒定，變性凝膠電泳法檢測RNA完整性，放入-80 ℃低溫冰箱留存待用。

1.8 實時熒光定量聚合鏈反應（qPCR）檢測血清miRNA-200c表達水平：使用miScriptⅡ反轉錄試劑盒將1 μg RNA反轉錄為cDNA，采用miScript SYBR Green PCR試劑盒，以U6為RNA內參進行qPCR檢測血清miRNA-200c表達水平，反應條件參照試劑盒說明書設置。miRNA-200c：5’-GCGCTAATACTGCCGGGTAATGAT-3’，77bp；U6：5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’，94 bp。miRNA-200c相對表達水平采用2-△△Ct法計算，實驗重復3次。

1.9 統計學方法：運用SPSS20.0統計軟件建立數據庫并進行統計分析，計量資料的統計描述用±s表示，兩組均數的比較用獨立樣本的t檢驗，定性資料的描述采用率或構成比，組間的率或構成比的比較采用χ2檢驗；運用Pearson或者秩相關性檢驗分析腎病綜合征患者血清中miRNA-200c表達水平與臨床檢測指標的相關性；采用多多元Logistics回歸分析腎病綜合征的主要影響因素。

2 結果

2.1 兩組人群一般情況比較：入組本研究的病例組和對照組分別由160例，均為72例男性人和88例女性。其中，病例組平均年齡（36.37±6.28）歲（18～68歲），對照組平均年齡（36.26±7.01）歲（18～69歲），無統計學差異（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組人群的生活行為和臨床指標對比：病例組和對照組的飲酒率、糖尿病史、空腹血糖、高密度脂蛋白（HDL）等指標差異無統計學意義（P＞0.05）。而病例組患者的吸煙率、BMI、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和β2-MG均高于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 病例組和對照組之間相關行為和實驗室檢測結果對比（±s）

表1 病例組和對照組之間相關行為和實驗室檢測結果對比（±s）

2.2 兩組人群血清microRNA-200c的表達水平分析：運用qPCR技術，檢測了腎病綜合征患者和健康對照組血清microRNA-200c的表達水平，結果顯示病例組的血清microRNA-200c的表達水平為（6.869±0.768），明顯高于對照組血清microRNA-200c的表達水平（1.138±0.151），有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 microRNA-200c與腎病綜合征患者相關指標的相關性分析：采用相關分析探索microRNA-200c與腎病綜合征患者臨床指標的相關性，結果顯示患者血清中microRNA-200c的表達與BMI、TC、TG、LDL及β2-MG呈正相關，與其他指標無相關性（P＞0.05），見表2。

2.4 腎病綜合征影響因素的多元Logistics回歸分析：在單因素logistic回歸分析基礎上，引入單因素分析有顯著性意義的因素，作多因素Logistic回歸分析，采用Backward：LR法，建立回歸模型，篩選出5個影響因素最終進入回歸方程，顯示BMI（OR=1.994）、TC（OR=3.061）、LDL（OR=3.551）、β2-MG（OR=2.231）、microRNA-200c（OR=8.147）是腎病綜合征的主要危險因素，其中microRNA-200c與腎病綜合征的關聯強度最大，見表3。

表2 血清中microRNA-200c與相關指標的相關性分析

表3 腎病綜合征影響因素的多元Logistic回歸分析結果

3 討論

原發性腎病綜合征是臨床上常見的腎小球疾病。近年來，本病的發病率有上升的趨勢[6]。目前，對于腎病綜合征的發病機制尚不完全清楚，若不及時給予有效治療，可能引發腎小管損傷、急性腎功能不全等并發癥，嚴重者可發展為慢性腎衰竭[7-8]。腎病綜合征早期癥狀不明顯，患者就診時往往已發展至終末期腎病。因此，探尋可靠、穩定和準確的方法來早期診斷本疾病，對及早采取正確的治療方法進行早期干預具有重要的臨床意義。

miRNA（MicroRNA）是一類長21～25 nt的單鏈小分子RNA，一般來源于染色體的非編碼區，具有高度保守性。近年的研究發現，miRNA在很多疾病的發生發展中具有重要的調控功能[9-10]。miR-200c是miR-200家族成員之一，其定位于染色體12p13.31[11]。miR-200c在腫瘤方面的研究較多，它在多種惡性腫瘤中異常表達，具有極強的抑癌基因活性，與上皮間質轉化（EMT）、腫瘤細胞的生長、增殖：侵襲、轉移及化療藥物敏感性密切相關[12]。然而，microRNA-200c在腎病綜合征角色的研究甚少。wang等[13]對尿液miRNAs進行研究發現IgAN患者尿miR-200a，miR-200b和miR-429水平下降。尿部分miRNA下降明顯的患者其蛋白尿水平較高，基線腎功能較差。隨訪（33.4±12.6）個月后，基礎尿miR-200b（r=0.316，P=0.034）較低患者其腎功能減退亦較明顯，提示這些尿miRNA片段對于原發性腎病綜合征的臨床表現及預后相關。他還發現，尿miR-29a，miR-192和miR-200c可能是診斷腎病綜合征和判斷疾病嚴重程度的生物標志物[14]。然而，miR-200c與原發性腎病綜合征的相關臨床指標關系如何，它與原發性腎病綜合征發生發展的關系如何仍未被闡明。

本研究選取在首診并診斷為原發性腎病綜合征的160患者作為病例組研究對象，按照1∶1 匹配的方法另選取160同期健康體檢人員為對照組。收集他們的臨床信息和血液樣本，檢測他們的血生化指標，并采用定量PCR技術檢測兩組人群血清microRNA-200c表達水平，分析其臨床意義。結果顯示原發性腎病綜合征患者血清中microRNA-200c的表達水平上調，它的表達與腎功能損傷和血脂指標具有相關性。腎病綜合征患者中，腎功能損傷指標和血脂指標是反應病情變化的重要指標，而本研究發現這兩類指標與microRNA-200c的表達相關性明顯，提示microRNA-200c可能與腎病綜合征的發生和發展過程密切相關。

本研究采用多元回歸分析方法，發現BMI、TC、LDL、β2-MG、microRNA-200c是腎病綜合征的主要危險因素，其中microRNA-200c與腎病綜合征的關聯強度最大，它是腎病綜合征發病的獨立危險因素，提示microRNA-200c可能是腎病綜合征潛在的新分子標志物。當然，本研究只是橫斷面研究方法探索microRNA-200c在腎病綜合征中的角色，它對腎病綜合征的診斷價值和預后預測能力，有待后續深入研究。