聚多巴胺涂層的偽模板分子印跡聚合物用于分離白頭翁皂苷B4*

張育珍，何家垣，蔣壯飛，馬蓉蓉，張起輝**

(1．西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021；2．重慶大學 化學化工學院，重慶 400044)

白頭翁[Pulsatillachinensis(Bge.)Regel]是一種傳統(tǒng)的常用中草藥，為毛茛科白頭翁屬植物，因其在清熱、涼血、排毒、抗腸道阿米巴痢疾以及細菌感染中的顯著作用而被廣泛使用[1-4]。近期研究表明，白頭翁中代表性成分白頭翁皂苷B4(AB4)具有良好的生物活性，包括抗氧化、抗癌等[5-7]。但是目前AB4分離和預富集的方法主要集中在柱色譜和制備液相上，這些純化方法需要昂貴的儀器或消耗大量有機溶劑以達到檢測和富集目的，會使目標產(chǎn)物回收率下降，并且花費大量時間在樣品前處理上，導致AB4標準品價格昂貴[8-9]。簡單、快速的從復雜天然產(chǎn)物中分離得到其有效成分，一直是人們面臨的難題。

分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)是一種在空間結(jié)構(gòu)上對特定分子具有識別性能的聚合物[10]，具有穩(wěn)定性好、選擇識別性高等特點[11]，已經(jīng)在很多領域包括固相萃取[12-14]、人造傳感器[15-17]、藥物分析[18-21]等有廣闊的應用前景。磁性表面分子印跡聚合物(MMIPs)具有殼-核結(jié)構(gòu)，結(jié)合位點位于印記表面，因此模板分子吸附和解吸速率快，而且結(jié)合磁性響應，只需磁控分離聚合物而不需要離心、過濾等冗雜操作[13]。多巴胺(DA)是一種含有鄰苯二酚和氨基官能團小分子化合物，在弱堿環(huán)境中，其通過自聚合形成具有黏附能力的化合物聚多巴胺(PDA)[22]。Chen等[23]以DA為功能單體合成了印跡材料并用于蛋白質(zhì)的預富集，Zhou等[24]利用DA自聚合形成PDA包裹在四氧化三鐵(Fe3O4)上，用于模板蛋白的識別。因此，期望基于DA為功能單體和交聯(lián)劑合成一種綠色、低成本的印記材料。然而，有些天然產(chǎn)物價格非常昂貴，這阻礙了印跡材料的發(fā)展。目前，以偽模板合成的印跡材料成功解決了模板不易洗脫、模板滲漏以及AB4作為模板分子昂貴的問題[25]。

作者采用表面分子印跡的方法，以磁性納米材料Fe3O4作為支撐材料，鼠李糖(Rha)作為模板，DA·HCl作為功能單體和交聯(lián)劑，制備出能識別糖苷配基的磁性分子印跡聚合物(Rha-MMIPs)。隨后對Rha-MMIPs進行表征，并結(jié)合高效液相(HPLC)用于中藥白頭翁中AB4定向預富集研究。

1 實驗部分

1.1 原料試劑與儀器

白頭翁藥材：購買于北京同仁堂，經(jīng)重慶大學張起輝副教授鑒定為白頭翁藥材。

AB4：純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；鹽酸·多巴胺(DA·HCl)、鼠李糖(Rha)：純度≥98%，阿達瑪斯試劑有限公司；甲醇、乙腈：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純，市售。

掃描電子顯微鏡(SEM)：merlin compact，德國蔡司公司；透射電子顯微鏡(TEM)：JEM 2100F，日本JEOL公司；傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)：IR-Affinity-1，日本島津公司；熱重分析儀：TGA/DSL1/1600LF，瑞士梅特勒-托利多公司；高效液相色譜儀(HPLC)：安捷倫1260，美國安捷倫公司。

1.2 磁性分子印跡材料(Rha-MMIPs)制備

首先通過水熱法制備Fe3O4納米粒子(Fe3O4NPs)[26-27]，步驟如下。向乙二醇中加入1.35 g六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)；隨后加入3.1 g無水醋酸鈉(NaAc)和0.4 g檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)，200 ℃下反應8 h。反應結(jié)束后，反復洗滌產(chǎn)物Fe3O4NPs直至中性，真空干燥8 h。隨后將75 mg Fe3O4分散于30 mL三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl，pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，超聲混勻，然后向溶液中加入75 mg模板分子Rha，在搖床上震蕩0.5 h。隨后將75 mg功能單體DA·HCl緩慢加入上述溶液中于30 ℃暗室反應12 h。反應結(jié)束后，磁控收集聚合物，用V(乙腈)∶V(乙酸)=9∶1混合溶液洗脫模板分子，隨后用無水乙醇和去離子水反復洗滌Rha-MMIPs直至中性，45 ℃真空干燥6 h。磁性分子印跡材料Rha-MMIPs合成步驟見圖1。

圖1 Rha-MMIPs合成及實際應用示意圖

在不添加模板分子的情況下，重復以上實驗步驟制備非印跡聚合物Rha-MMIPs，作為對照。

1.3 吸附實驗

1.3.1 吸附熱力學實驗

將AB4標準品(結(jié)構(gòu)式見圖2)溶于Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，配置一系列AB4標準溶液(10、20、40、60、80、100 μg/mL)，分別將15 mg的Rha-MMIPs/Rha-MNIPs添加到AB4標準溶液中，隨后將混合物放置在90 r/min、30 ℃搖床上反應。4 h后，磁控分離得到上清液。用HPLC測定峰面積，對照AB4標準曲線，計算Rha-MMIPs和Rha-MNIPs吸附后溶劑的濃度。平衡時吸附量Q按照公式(1)計算。

圖2 AB4結(jié)構(gòu)式

Q=(ρ0-ρe)×Vm

(1)

式中：Q為Rha-MMIPs或Rha-MNIPs對目標化合物的吸附量，mg/g；ρ0為AB4初始質(zhì)量濃度，μg/mL；ρe為平衡時上清液中AB4質(zhì)量濃度，μg/mL；V為吸附體積，mL；m為聚合物的質(zhì)量，mg。

1.3.2 吸附動力學實驗

將15 mg印記聚合物Rha-MMIPs/Rha-MNIPs加入ρ(AB4)=80 μg/mL溶液中，在90 r/min、30 ℃搖床上分別反應5、10、20、30、40、60、90、120 min。不同時間段在磁場作用下分離，得到上清液。隨后用微孔濾膜過濾并利用HPLC定量分析，并計算上清液中ρ(AB4)。Rha-MMIPs或Rha-MNIPs的吸附量由式(1)計算。

1.4 Rha-MMIPs重現(xiàn)性實驗

重現(xiàn)性是影響印跡聚合物應用非常重要的因素。在相同的條件下，合成6批印跡材料，每批聚合物取15 mg，加入ρ(AB4)=80 μg/mL溶液中，在搖床上，以90 r/min的轉(zhuǎn)速、30 ℃反應60 min，隨后利用磁場進行分離，取上清液過濾，并用HPLC定量計算上清液中ρ(AB4)。按照公式(1)計算6批Rha-MMIPs對AB4的吸附性能，從而評價Rha-MMIPs的重現(xiàn)性。

1.5 磁性分子印跡材料的實際應用

1.5.1 白頭翁提取

每次加入200 mLφ(乙醇)=70%溶液于20 g白頭翁粉末中分別提取3次，合并濾液，隨后用等體積石油醚萃取3次，濃縮下層溶液得浸膏。隨后浸膏用甲醇溶解待用。接著用活化好的D101大孔樹脂分離，收集φ(乙醇)=50%洗脫液，濃縮得浸膏并用甲醇溶解，得到ρ(甲醇)=50 mg/mL溶液。

1.5.2 磁性分子印跡材料的實際應用

取上述甲醇溶液3 mL并用N2吹干，加入3 mL Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液復溶。之后向溶液中加入15 mg Rha-MMIPs，將混合物在振蕩器上以90 r/min的轉(zhuǎn)速、30 ℃反應60 min，用HPLC檢測吸附前以及洗脫液中ρ(AB4)。

1.6 色譜條件

色譜柱為TC C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫，0～6 min 30%～35% B，6～8 min 35%～100% B，8～12 min 100%～100% B，12～15 min 100%～30% B，流速1 mL/min；檢測波長201 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Rha-MMIPs的SEM和TEM

Fe3O4NPs、Rha-MMIPs的SEM和TEM見圖3。

a Fe3O4 NPs的SEM圖

由圖3a可知，F(xiàn)e3O4NPs呈球形顆粒、分散性較好、粒徑均一，可以作為基質(zhì)材料。由圖3b可知，印跡層包裹在基質(zhì)材料上，表面相對粗糙、分散性好、大小均勻。由圖3c和圖3d可知，Rha-MMIPs殼-核結(jié)構(gòu)明顯，其中Fe3O4NPs直徑約200 nm，其外面包裹的印跡層約40 nm，表明已經(jīng)成功制備出殼-核結(jié)構(gòu)的印記聚合物。

2.2 Rha-MMIPs的結(jié)構(gòu)特性

2.2.1 紅外光譜表征

采用紅外光譜表征Rha-MMIPs鍵合情況，結(jié)果見圖4。

σ/cm-1

2.2.2 熱重表征

采用熱重分析儀表征聚合物的熱穩(wěn)定性，Rha-MMIPs熱重分析見圖5。

t/℃

由圖5可知，當溫度達到130 ℃，Rha-MMIPs質(zhì)量減少3.04%，主要由于印記材料中水分的蒸發(fā)。當溫度升高至340 ℃，其質(zhì)量一直在減少，質(zhì)量損失達到14.27%，這可能由于Rha-MMIPs表面印跡層以及有機成分的分解。結(jié)果表明Rha-MMIPs在130 ℃以內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2.3 樣品磁性分析

Rha-MMIPs的磁性分離效果圖見圖6。

a Rha-MMIPs在溶液中分散圖

由圖6a可知，Rha-MMIPs在Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，分散性較好，沉淀速度緩慢；在外加磁場作用下，Rha-MMIPs能快速(30 s)聚集到瓶壁，與溶液分開(見圖6b)。這表明Rha-MMIPs具有一定的磁性，并且能達到磁性分離的效果，可以用于復雜樣品中磁控分離。

2.3 Rha-MMIPs的吸附性能分析

2.3.1 Rha-MMIPs的等溫吸附特性

Rha-MMIPs和Rha-MNIPs的等溫吸附曲線見圖7a。由圖7a可知，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs吸附量隨著初始質(zhì)量濃度的增加而增加。ρ(Rha-MMIPs)=80 μg/mL時，吸附能力達到5.80 mg/g，明顯大于Rha-MNIPs最大吸附量。這主要由于Rha-MMIPs表面吸附位點提高了其對AB4的吸附能力。而Rha-MNIPs的吸附能力是由聚多巴胺引起的。

利用Langmuir和Freundlich等溫吸附模型對靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)進行擬合。

Langmuir等溫吸附模型見式(2)。

ρeQ=1QmaxKL+ρeQmax

(2)

Freundlich等溫吸附模型見式(3)。

logQ=mlogρe+logKF

(3)

式中：Qmax為飽和吸附量，mg/g；KL為Langmuir等溫方程的平衡常數(shù)，mL/mg；擬合結(jié)果見圖7b。KF為Freundlich等溫吸附模型的平衡常數(shù)，mg/g；m為Freundlich等溫吸附模型的非均質(zhì)性指數(shù)。

ρ/(μg·mL-1)a 等溫吸附曲線

平衡常數(shù)和相關系數(shù)見表1。

由表1可知，Langmuir等溫吸附模型更適合Rha-MMIPs對AB4的吸附性能，其R2(0.998 2)高于Freundlich等溫吸附模型，表明Rha-MMIPs與AB4屬于單層吸附結(jié)合，可能源于材料表面空穴是均勻的。

表1 Langmuir等溫吸附模型和Freundlich等溫吸附模型參數(shù)

2.3.2 Rha-MMIPs的動力學特性

對Rha-MMIPs和Rha-MNIPs進行吸附動力學分析，結(jié)果見圖8。

t/mina 吸附動力學曲線

由圖8a可知，隨著吸附時間增加，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs對AB4的吸附量也隨之增加，當吸附時間為60 min，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs均達到吸附平衡。此外，Rha-MMIPs對AB4的吸附量遠高于Rha-MNIPs，這說明Rha-MMIPs對AB4具有更大的親和力。

為了進一步研究Rha-MMIPs對AB4的吸附動力學，對吸附數(shù)據(jù)進行準一級動力學和準二級動力學模擬，相關參數(shù)見表2。準二級動力學擬合曲線見圖8b。由表2可知，準二級動力學具有較高的相關系數(shù)，更符合Rha-MMIPs對AB4的吸附。這也進一步表明，化學吸附是Rha-MMIPs吸附過程中的決速步驟。

準一級動力學方程見式(4)。

ln/(Qe-Qt)=lnQe-K1t

(4)

準二級動力學方程見式(5)。

tQt=1K2Q2e+tQe=1v0+tQe

(5)

式中：Qe和Qt分別為在平衡和時間t(min)時吸附劑的吸附容量，mg/g；v0為初始吸附速率， mg/(g·min)；K1為準一級方程的平衡速率常數(shù)， min-1；K2為準二級方程的平衡速率常數(shù)，g/(mg·min)。

表2 Rha-MMIPs模擬的兩種動力學參數(shù)

2.4 Rha-MMIPs的重現(xiàn)性

不同批次Rha-MMIPs的吸附量見圖9。

批次

由圖9可知，相同條件下不同批次Rha-MMIPs對AB4的吸附量基本相同，表明Rha-MMIPs具有良好的穩(wěn)定性和可重復使用性，Rha-MMIPs可以作為固相萃取劑廣泛應用。

2.5 Rha-MMIPs的應用

白頭翁中的AB4經(jīng)Rha-MMIPs吸附前以及Rha-MMIPs洗脫液液相色譜圖見圖10。通過AB4標準溶液的色譜圖可知在保留時間約為8.0 min為AB4色譜峰。比較吸附前以及洗脫液色譜峰發(fā)現(xiàn)，AB4色譜峰變化很大，表明AB4已被Rha-MMIPs吸附，而白頭翁中其他物質(zhì)峰面積基本保持不變，這可能因為AB4糖鏈末端為Rha以及印記空穴大小和氫鍵作用。因此實驗制得的Rha-MMIPs可從白頭翁粗提物中預富集AB4，可廣泛用于AB4的固相萃取。

t/mina AB4標準品

3 結(jié) 論

采用表面分子印跡方法，以低成本、綠色化學理念，制備出能識別糖苷類化合物的Rha-MMIPs，該聚合物具有較好的磁性和熱穩(wěn)定性，其對AB4具有較強的吸附親和力，能快速識別并磁控分離白頭翁中的AB4。此外，Rha-MMIPs具有良好的重現(xiàn)性。為研究糖苷類化合物提供了新的固相萃取劑，對于降低AB4標品價格、加快AB4的檢測速度以及提高檢測的靈敏度具有非常重要的意義。