卵巢上皮性癌組織中CXCL13、CXCR5表達觀察

劉瑩，張蓓，杭佳

1 徐州醫科大學，江蘇徐州221000； 2 徐州醫科大學徐州臨床學院

卵巢癌是一種高致死性婦科惡性腫瘤。病灶局限于卵巢的卵巢癌患者有約90%的無事件生存率，但超過70%的的患者確診時已處于晚期，疾病5年生存率僅為20%～30%[1]。探尋卵巢癌發生發展的具體作用機制，對卵巢癌的治療及預后具有重要意義。

趨化因子是一種低分子量、具有保守的二級結構及超二級結構的蛋白家族[2]，趨化因子受體是異三聚體G蛋白偶聯7跨膜螺旋結構域超家族[3]，CXC亞家族趨化因子13(CXCL13)/CXC亞家族趨化因子13受體(CXCR5)信號軸是趨化因子信號通路中的一種，CXCL13由基質細胞在次級淋巴組織的B細胞區域(如脾、淋巴結、扁桃體和派爾集合淋巴結)分泌[4]，CXCR5在成熟循環B淋巴細胞、部分濾泡輔助性T細胞和皮膚來源的遷移樹突狀細胞上高度表達，并控制它們趨近CXCL13的梯度，向二級淋巴器官遷移[5]。CXCL13及CXCR5的異常表達及結合可通過激活細胞內NF-κB信號、PI3K-AKT通路等影響腫瘤細胞轉錄、增殖、侵襲、轉移，如前列腺癌、乳腺癌、喉鱗狀細胞癌、結直腸癌等[6～9]，但CXCL13、CXCR5在卵巢上皮性癌組織中的表達及其作用機制目前尚無研究。2018年12月～2019年12月，我們觀察了卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5的表達變化，并分析癌組織中CXCL13、CXCR5的表達與患者臨床病理參數及預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2014年6月在徐州市中心醫院和徐州醫科大學附屬醫院婦科收治的卵巢上皮性癌患者80例，術前均未接受化療、放療或者激素治療，均行卵巢癌全面分期手術或腫瘤細胞減滅術，術后規律化療，鉑類為基礎化療≥4次，病理證實為卵巢上皮性癌，根據國際婦產科聯盟(FIGO)2009年的分期標準分為Ⅰ期10例、Ⅱ期12例、Ⅲ期45例、Ⅳ期13例，其中Ⅰ～Ⅱ期為早期、Ⅲ～Ⅳ期為晚期；根據組織學類型分類為漿液性癌56例、黏液性癌12例、子宮內膜樣癌6例、透明細胞癌 6例；根據病理分化程度分類為高分化12例、中分化13例、低分化55例。其病理診斷均經兩位有5年以上經驗的副高級以上病理科醫師確診，患者臨床病理資料均完整，術中保留卵巢上皮癌組織80例份(觀察組)。另取同期因子宮肌瘤或宮頸良性病變行子宮及一側(或雙側)附件切除術，且術后經病理檢查證實為正常卵巢組織標本40例份作為對照組。本研究經各醫院倫理委員會批準，樣本采集取得患者本人或家屬知情同意。

1.2 癌組織及正常卵巢組織CXCL13、CXCR5檢測 采用免疫組化法。甲醛固定組織標本，常規石蠟包埋， 4μm切片，實驗步驟按照超敏兔二步法檢測試劑盒說明書進行，經烤片、脫蠟、水化后，EDTA抗原修復液微波進行抗原修復高火3 min，低火7 min，冷卻、PBS沖洗；滴加一抗(CXCL13一抗滴度1∶150，CXCR5一抗滴度為1∶100；以 PBS代替一抗為陰性對照)，37 ℃孵育1.5 h，PBS沖洗；滴加二抗(快捷型酶標羊抗兔IgG聚合物)，室溫孵育20 min，PBS沖洗；滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察并控制顯色時間，每張切片顯色1～2 min，自來水沖洗終止顯色；蘇木素復染、返藍、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片固定。CXCL13多克隆抗體購自美國NOVUS公司，CXCR5多克隆抗體購自英國Abcam公司；超敏兔二步法檢測試劑盒、抗體稀釋液、DAB等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。CXCL13主要表達于細胞質，CXCR5主要表達于細胞質及細胞膜。400倍鏡下由兩位病理科醫師隨機選取5個不同視野的代表性區域，采用乘法積分法進行判定，依照陽性細胞數及染色強度進行評分，陽性細胞占計數細胞比例<5%計0分、5%～25%計1分、25%～50%計2分、50%～80%計3分、≥80%計4分；細胞染色強度為無著色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分，細胞染色強度評分和陽性細胞比例評分相乘得到最終得分，5個視野取平均值。總分0～4分為陰性表達、5～12分為陽性表達，并計算CXCL13、CXCR5陽性表達率。

1.3 預后隨訪方法 以電話或來院復查形式對80例卵巢上皮性癌患者進行隨訪，患者手術日期為隨訪起點，死亡日為隨訪終點，隨訪截止時間為2019年06月30日，隨訪時間為60～107個月(中位隨訪時間74個月)。

1.4 統計學方法 采用SPSS Version 25.0統計軟件進行處理。癌組織與正常組織CXCL13、CXCR5的表達比較采用χ2檢驗，相關性分析采用四格表χ2檢驗，預后情況采用Kaplan-Meier生存分析及Cox回歸分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組CXCL13、CXCR5陽性表達率比較 觀察組、對照組CXCL13陽性表達率分別為56.25%(45/80)、15.0%(6/40)(χ2= 18.568，P=0.000)，觀察組、對照組CXCR5陽性表達率分別為48.75%(39/80)、7.5%(3/40)(χ2= 19.945，P=0.000)。

2.2 卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5表達與患者臨床病理參數的關系 卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5陽性表達與FIG0分期晚、伴有淋巴結轉移相關(P均<0.05)，與患者年齡、病理類型及腫瘤直徑均無關(P均>0.05)，見表1。

表1 不同卵巢上皮性癌患者癌組織CXCL13、 CXCR5陽性率

2.3 卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5表達與患者預后的關系 80例患者中，卵巢上皮性癌組織CXCL13表達陰性、陽性者的生存時間分別為52.2、32.4月(χ2= 9.179，P=0.002)。卵巢上皮性癌組織CXCR5表達陰性、陽性的生存時間分別為51.0、31.5月(χ2= 11.836，P=0.001)。年齡、病理類型不是影響卵巢上皮性癌預后的危險因素(P均>0.05)；病理學分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移情況、原發腫瘤最大直徑、術后殘留灶直徑、CXCL13及CXCR5陽性表達為影響卵巢上皮性癌預后的重要危險因素(P均<0.05),見表2。將病理學分化程度、FIGO分期、原發腫瘤最大直徑、術后殘留灶直徑、CXCL13及CXCR5納入Cox多因素分析，結果顯示病理分化程度、FIGO分期、原發腫瘤最大直徑、術后殘留灶直徑是卵巢上皮性癌的獨立預后因素，見表3。

表2 卵巢上皮性癌患者預后的單因素COX分析結果

表3 卵巢上皮性癌患者預后的Cox多因素分析結果

3 討論

趨化因子是一種低分子量、具有保守的二級結構及超二級結構的蛋白家族，根據氨基酸排列順序及連接多肽的二硫鍵不同分4類：C、CC、CXC和CX3C，趨化因子受體是異三聚體G蛋白偶聯7跨膜螺旋結構域(GPCR-7TM)超家族，趨化因子配體/受體的相互作用，對特異性白細胞亞群精細調節、細胞吸引起關鍵作用[10]。CXCL13/CXCR5信號軸是趨化因子信號軸中的一種，異常表達的CXCL13/CXCR5信號通路與多種實體腫瘤的遷移、侵襲、免疫相關[11]。本研究結果發現，CXCL13及CXCR5在卵巢癌組織的陽性表達率均高于正常卵巢組織，與在乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌[9, 12, 13]中的相關研究結論一致，提示CXCL13/CXCR5異常表達可能與卵巢癌的發生、發展有關。

在前列腺癌組織中，腫瘤微環境中CXCL13及CXCR5相互作用可能通過細胞外調節蛋白激酶(ERK), PI3K/AKT,應激活化蛋白激酶 (SAPK)/c-jun 蛋白激酶(JNK),及 C型蛋白激酶(PKCε)/ NF-κB等信號通路，促進前列腺癌腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。雄激素/雄激素受體誘導的CXCL13過表達可增加前列腺癌細胞中細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、轉錄因子Ets-1和鋅指轉錄因子Snail的產生，從而促進了細胞周期和細胞相(G2/M)的轉變，增強雄激素受體介導的前列腺腫瘤細胞的生長、增殖、上皮-間質轉化(EMT)、遷移和侵襲[14]。在乳腺癌中，CXCL13/CXCR5信號通路可能通過ERK介導釋放炎性細胞因子白介素(IL-1β)和腫瘤壞死因子促進乳腺癌進展[7]。也有研究[15]表明CXCR5的表達升高可能有助于缺乏功能性抑癌基因p53的乳腺腫瘤的異常細胞存活和遷移。在結直腸癌中，CXCL13/CXCR5信號軸可能激活PI3K/AKT通路，通過分泌基質金屬蛋白酶MMP-13促進腫瘤細胞的發病、遷移和侵襲[16]。在肺癌中，CXCL13/CXCR5相互作用誘導腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)分泌磷蛋白1 (SPP1)，SPP1可能形成一個正反饋循環網絡，通過激活和核本地化上皮細胞和腫瘤細胞上的β連環蛋白促進EMT和肺癌進展[17]。本研究對CXCL13及CXCR5表達情況與卵巢上皮性癌臨床病理參數進行分析，CXCL13及CXCR5的表達與患者年齡、病理類型及腫瘤直徑均無顯著關系，CXCL13表達與更高的FIGO分期、伴有淋巴結轉移相關，CXCR5表達與病理分化差、更高的FIGO分期及伴有淋巴結轉移相關，提示CXCL13及CXCR5與卵巢癌轉移、遷徙、進展相關，可作為評估腫瘤進展的指標。根據CXCL13及CXCR5的生理作用及在其他癌癥中的作用機制，推測可能通過細胞內促癌信號通路激活，影響癌細胞自身增值、轉移、侵襲能力；或通過調節腫瘤微環境中免疫細胞組成及分化，調節癌細胞增殖、轉移、侵襲，其具體的信號傳遞機制還有待進一步研究。

本研究發現，CXCL13及CXCR5陽性表達卵巢上皮性癌患者的生存時間更短，多因素相關分析顯示病理分化程度、FIGO分期、原發腫瘤最大直徑、術后殘留灶直徑是影響卵巢癌預后的獨立危險因素，而CXCL13及CXCR5不是影響卵巢上皮性癌預后的獨立危險因素，但根據CXCL13及CXCR5臨床病理學因素的相關性，及單因素分析其為影響卵巢上皮性癌預后的危險因素，推測CXCL13及CXCR5可能通過影響卵巢上皮性癌進展某過程而影響預后，可作為判斷卵巢上皮性癌患者預后的參考指標，阻斷CXCL13及CXCR5途徑可能有望為新的抗腫瘤治療的可能靶點。

本研究為回顧性研究，存在選擇偏倚可能，實驗僅采用臨床標本進行免疫組化研究，有待進一步擴大樣本量及用其他實驗方法驗證研究結果，對CXCL13及CXCR5與卵巢上皮性癌的具體關系有待進一步探索，其調節癌細胞增殖、轉移、侵襲具體的信號傳導機制還有待進一步研究。

綜上所述，卵巢上皮性癌組織中CXCL13、CXCR5表達升高。CXCL13、CXCR5與FIG0分期晚、伴有淋巴結轉移呈正相關，病理分化程度、FIGO分期、原發腫瘤最大直徑、術后殘留灶直徑是卵巢上皮性癌的獨立預后因素。CXCL13、CXCR5可能參與了卵巢上皮性癌的發生發展，可作為卵巢上皮性癌不良預后的參考指標及潛在治療靶點。