宮頸癌組織中微小RNA-585、性別決定區Y-box 9 mRNA的表達變化及其臨床意義

朱軍，姚超

十堰市婦幼保健院，湖北十堰 442000

宮頸癌是全球女性中第二大常見腫瘤，也是腫瘤相關死亡的第四大原因[1]。盡管目前已經使用包括手術、化療、放療和靶向治療在內的綜合治療來改善宮頸癌患者的臨床癥狀，但是患者的預后仍然不滿意，5年生存率較低，約為40%[2]。因此新的宮頸癌治療手段迫切需要研究。微小RNA(miRNA)是一類由19～25個核苷酸組成的新型小型非編碼RNA，可參與細胞發育、增殖、轉移、代謝、分化、細胞周期和凋亡等生物學過程[3]。近幾十年，miRNA在腫瘤中的生物學功能成為腫瘤研究的熱點，可以作為腫瘤治療靶點抑制惡性腫瘤進展[4]。miR-585是新近發現的miRNA之一，首次在非小細胞肺癌(NSCLC)中被報道，被認為是NSCLC復發的預后標志物[5]。miR-585可抑制結直腸癌、NSCLC和胃癌的發生發展[6]，miR-585在宮頸癌中的研究未見有報道。此外miRNA可通過降解mRNA或抑制翻譯在轉錄后水平調節靶基因表達，生物學軟件預測性別決定區Y-box 9(SOX9)可能是miR-585的靶基因，SOX9在不同的腫瘤中的表達水平及發揮的作用不同[7]，同時在宮頸癌中發揮的作用仍有爭議[8]。我們觀察了宮頸癌組miR-585、SOX9 mRNA的表達變化情況，并探討其臨床意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2014年1月期間我院診治的宮頸癌患者80例(觀察組)，年齡30～62(45.87±12.63)歲，>50歲者52例，≤50歲者28例；宮頸鱗癌48例，腺癌32例；FIGO分期為ⅠA2期10例，ⅠB1期19例，ⅠB2期22例，ⅡA1期18例，ⅡA2期11例；組織學分級為中高分化45例，低分化35例；淋巴結轉移23例，無淋巴結轉移57例；浸潤深度：淺肌層例37例，深肌層43例。納入標準：初次診治，未接受過放化療、免疫治療及靶向治療等抗腫瘤治療；穿刺活檢或術后組織經2位病理專家明確診斷為宮頸癌；完整的臨床病例資料和隨訪資料。及排除標準：合并其他惡性腫瘤；患有嚴重的宮頸炎；患有威脅生命健康的全身性疾病。另選擇宮頸良性病變(子宮肌瘤)組織40例作為正常對照組，年齡35～58(47.36±9.24)歲，兩組年齡具有可比性。兩組均行手術切除腫瘤或子宮肌瘤，術中保存保留宮頸癌及宮頸良性病變組織。本研究倫理由我院倫理委員會審核通過，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 DP501 miRcute miRNA 提取分離試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo公司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-585、SOX9、內參U6和GAPDH引物由美國Invitrogen公司合成；Nanodrop2000分光光度儀購自美國Thermo公司；7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 宮頸癌及宮頸良性病變組織miR-585、SOX9 mRNA檢測 應用qRT-PCR法。手術中切除新鮮病理組織快速置于-80 ℃液氮凍存后，按照miRNA 提取分離試劑盒說明書提取組織中總的RNA，測得RNA的濃度和純度后，放置-80 ℃冰箱保存備用。以提取的總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒進行逆轉合成cDNA。以cDNA為模板，按照qPCR試劑盒說明書配制反應體系，反應條件為：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃，30 s，40個循環。每個樣品設置3個反應復孔，得到各樣品的循環閾值(threshold cvcle，Ct)。以U6基因為內參，以2-ΔΔCt代表miR-585相對表達量，其中ΔCt=CtmiR-585-CtU6。以GAPDH基因為內參，以2-ΔΔCt法代表SOX9 mRNA相對表達量，其中ΔCt=CtSOX9-CtU6。miR-585引物F: 5′-ACGCGTTCTCCTTACCATCCCTGA-3′, R: 5′-CGATCTGGAAGTAACCCAAGCC-3′；SOX9引物F: 5′-AGCGAACGCACATCAAGAC-3′, R: 5′-CTGTAGGCGATCTGTTGGGG-3′；內參U6引物F: 5′-GATTCCTATGTGGGCGACGAG-3′, R: 5′-CCATCTC-TTGCTCGAAGTCC-3′。內參GAPDH引物F: 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′, R: 5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。

1.4 隨訪方法 觀察組術后每1～3個月隨訪1次，由專業隨訪人員采用電話及門診的方式進行，隨訪時間為術后60個月，直至患者死亡或者截止到隨訪時間2019年1月。收集數據，計算患者生存時間。

1.5 miR-585與SOX9靶向關系的預測 利用Target Scan7.2生物學信息軟件(tp://www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-585與SOX9靶向關系。

2 結果

2.1 兩組miR-585和SOX9 mRNA相對表達量比較 觀察組、對照組miR-585相對表達量分別為0.83±0.39、1.00±0.36，二者比較，P<0.05；觀察組、對照SOX9 mRNA相對表達量分別為1.00±0.48、1.46±0.75，二者比較，P<0.05。

2.2 miR-585、SOX9 mRNA表達與宮頸癌組織患者臨床病理參數之間的關系 見表1。miR-585、SOX9 mRNA的表達與宮頸癌患者的年齡、組織類型和組織學分級均無關(P均>0.05)，與宮頸癌患者FIGO分期、淋巴結轉移和浸潤深度顯著相關(P均<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數的宮頸癌患者癌組織 miR-585、SOX9 mRNA表達

2.3 宮頸癌組織中miR-585、SOX9 mRNA表達對患者預后的影響 80例宮頸癌患者成功隨訪73例，有7例失訪病例，共45例患者5年內死亡，5年生存率為38.36%(28/73)。

按miR-585在宮頸癌組織中的相對表達量平均數0.83為界，將80例宮頸癌患者分為miR-585低表達患者(41例)和miR-585高表達患者(39例)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，miR-585低表達組失訪3例，38例中死亡29例，5年生存率為23.68%(9/38)；miR-585高表達組失訪4例，35例中死亡16例，5年生存率為54.29%(19/35)；與miR-585高表達患者相比，miR-585低表達患者預后較差(χ2=7.11，P=0.008)。按SOX9 mRNA在宮頸癌組織中的相對表達量平均數1.46為界，將80例宮頸癌患者分為SOX9低表達患者(49例)和SOX9高表達患者(31例)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，SOX9低表達組失訪4例，45例中死亡23例，5年生存率為48.89%(22/45)；SOX9高表達組失訪3例，28例中死亡22例，5年生存率為21.43%(6/28)；與SOX9mRNA低表達患者相比，SOX9mRNA高表達患者預后較差(χ2=6.57，P=0.010)。

2.4 miR-585與SOX9mRNA靶向關系 SOX9的3′UTR區存在miR-585的結合位點。見圖1。

圖1 miR-585與SOX9的3′UTR區的結合位點

2.5 miR-585和SOX9mRNA在宮頸癌組織中表達相關性 miR-585與SOX9mRNA在宮頸癌組織中的表達呈負相關(r=-0.315，P=0.006)。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]。其中，34～44歲年齡組女性是宮頸癌高發人群。由于宮頸癌患者早期癥狀不明顯，晚期患者出現迄今已確定的兩種轉移類型，包括淋巴結和遠處器官的轉移，使得目前宮頸癌的治療手段有限，達不到預期的治療效果，轉移性宮頸癌預后十分差，中位生存期僅為8～13個月，與其他腫瘤一樣，轉移進展是宮頸癌治療的難點[9]。針對晚期患者的分子靶向藥物開啟了惡性腫瘤的全新治療治療模式，宮頸癌現有的分子靶向藥物并不能達到理想的臨床治療效果，在現有的治療基礎上尋找不同的分子靶向藥物，實施聯合治療的方法為宮頸癌的治療提供新的方向[10]。目前人乳頭瘤病毒HPV被認為是宮頸癌主要的致病因子，超過99%的宮頸癌患者持續存在HPV感染，此外還有許多與致癌作用有關的危險因素[11]，但是宮頸癌的發病機制尚未完全明確，因此探索宮頸癌進展過程的分子機制對于新型治療靶標的開發是迫切需要的。

已知超過四分之一的人類miRNA在至少一種腫瘤類型中顯著失調，這表明miRNA可能代表腫瘤惡性進展過程中新型基因調節因子之一[12]。已經在多種類型的腫瘤中鑒定出miRNA異常表達譜，這些成千上百個表達失調的miRNA可以通過作為癌基因或腫瘤抑制因子發揮致癌作用[4，5]。越來越多的研究表明，各種miRNA參與了宮頸癌的進展，是宮頸癌潛在的治療靶點和預后生物標志物[6]。miR-585是眾多抑癌因子之一，目前關于miR-585的研究較少，Chen等[13]報道miR-585表達升高參與冠狀動脈疾病的發生；循環腫瘤RNA_102958通過miR-585/CDC25B軸在結直腸癌中發揮新型致癌作用[8]；在NSCLC組織和細胞系中miR-585的表達下調，miR-585的異位表達在體外抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲的能力以及在體內miR-585降低了裸鼠中異種移植腫瘤的生長速度[9]。而miR-585在宮頸癌中的表達情況未知，本文采用qPCR檢測發現miR-585在宮頸癌組織中表達下調，并與患者的FIGO分期、淋巴結轉移、浸潤深度和生存預后較差顯著相關，可能是抑癌因子，與miR-585在胃癌組織和細胞系中表達下調，并且miR-585的表達與胃癌侵襲程度、TNM分期、淋巴結侵襲和預后不良相關的結果[10]相似。本研究結果提示miR-585可能是宮頸癌預后不良生物標志物和治療候選靶標。

成熟miRNA是通過與靶基因的3′非翻譯區(UTR)內的種子位點互補結合引起mRNA的降解或翻譯抑制來參與多種信號傳導途徑的調控[4]。miRNA的靶基因不止一個，在腫瘤中已經證實的miR-585靶基因有CDC25B、hSMG-1和MAPK1[8]，我們采用Target Scan7.2生物學信息軟件發現SOX9的3′UTR區存在miR-585的結合位點，可能是miR-585的靶基因。SOX9屬于SOX家族成員之一，由DNA結合結構域組成，包括保守的高遷移率基團(HMG)。SOX9是HMG-box類中的轉錄因子，影響細胞的存活、增殖和分化，SOX9依賴于腫瘤的來源可以作為癌基因和腫瘤抑制因子[11，12]。而目前SOX9在宮頸癌中的報道不一致，研究[13]發現，與正常宮頸組織相比，原位宮頸癌尤其是浸潤性宮頸癌中SOX9的表達逐漸降低。SOX9的過表達抑制體外細胞生長和體內腫瘤形成，為抑癌基因。Liu等[8]報道SOX9在宮頸癌組織中表達增加，并作為miR-215-3p的靶基因促進宮頸癌的進展。此外，SOX9表達升高促進宮頸癌細胞對順鉑的化學耐藥[9]。本文采用qPCR檢測發現SOX9在宮頸癌組織中表達上調，并與患者的FIGO分期、淋巴結轉移、浸潤深度和生存預后較差顯著相關，可能是促癌因子，與Liu等[8]的研究一致，而與研究[13]相反，可能是樣本來源和樣本量等不同導致的。同時我們分析了miR-585和SOX9兩者在宮頸癌組織中的表達相關性，結果顯示兩者表達呈負相關性，表明miR-585可能通過負調控SOX9抑制宮頸癌進展，但其具體作用機制仍需后續探討。

綜上所述，宮頸癌組織中miR-585表達增加，SOX9 mRNA表達降低，兩者表達呈負相關性，miR-585可能通過靶向SOX9 mRNA抑制宮頸癌的進展。miR-585 和SOX9 mRNA均與患者不良預后相關，可能是宮頸癌患者預后不良的生物標志物和治療的新型靶點。