宮頸癌組織中死亡相關蛋白激酶3 mRNA的表達變化及其臨床意義

孟俠，王靜依，向睿，劉海鳳

核工業四一六醫院，成都 610051

我國宮頸癌(CC)每年新發病例數約13.1萬例，死亡例數約5.3萬例，嚴重威脅女性健康[1]。CC的治療方法包括手術治療、放化療及分子靶向治療等，但對于中晚期患者治療效果差，預后不佳，5年總體生存率僅為40%[2]。深入研究CC發生、發展的分子機制，對CC早期診斷、尋找新的治療藥物及預后評估具有重要的意義。死亡相關蛋白激酶3(DAPK3)基因位于染色體19p13.3，是死亡相關蛋白激酶家族的成員，除了N末端催化結構域外，該激酶還具有亮氨酸拉鏈結構域, 具有促進細胞凋亡的作用[3]。近年來研究表明DAPK3在腎細胞癌[4]、肺癌[5]等多種腫瘤中表達下調，DAPK3通過激活腫瘤細胞中的ERK / c-Myc信號傳導來控制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等生物學行為，DAPK3 表達下調后促進腫瘤細胞的增殖及惡性進展[6]。目前關于DAPK3在CC中的表達相關報道較少。我們觀察了DAPK3mRNA在CC癌組織及癌旁正常組織中的表達變化，并分析其與臨床病理參數的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2014年5月期間于我院診治的93例CC患者，年齡28～59(43.3±7.5)歲；病理類型：宮頸鱗癌71例，宮頸腺癌22例；腫瘤分化程度為高分化25例，中分化36例，低分化32例；參考2009年國際婦產科聯盟FIGO標準[7]為Ⅰ期31例，Ⅱ期36例，Ⅲ期26例；伴淋巴結轉移53例，無淋巴結轉移40例; 腫瘤浸潤深度為淺肌層37例，深肌層56例。納入標準：①CC診斷經活檢病理或術后病理檢查確診;②所有CC患者均為初次診治，既往無其它抗腫瘤治療;③患者臨床病理及隨訪資料完整。排除標準：①同時合并其它器官的惡性腫瘤;②合并感染性疾病，如細菌性感染、結核菌感染等;③合并嚴重心功能衰竭、肝功能衰竭等的臟器功能不全。CC患者93例患者均行腫瘤切除術，術中保存癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)。所有患者自確診之日起開始隨訪，每3月隨訪1次，以門診或電話方式隨訪，隨訪內容包括患者疾病進展情況及生存情況等。隨訪截止日期2019年5月，隨訪1～60個月，中位隨訪時間47.2個月。

1.2 癌組織及癌旁正常組織DAPK3 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法。取約50 mg癌組織及癌旁正常組織標本，TRIzol法提取總RNA，溶于50 μL DEPC水中，Narodrop上檢測RNA濃度。以總RNA為模板，進行逆轉錄合成cDNA，實驗步驟嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行。DAPK3正向引物序列：5′-GCACGACATCTTCGAGAACAA-3′，反向引物序列：5′-CTTAGAGTGCAGGTAGTGAACG-3′，內參基因GAPDH上游序列:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列: 3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。熒光定量PCR反應條件為：95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，變性退火延伸40個循環。以GAPDH為內參， 以2-ΔΔCt代表DAPK3 mRNA的相對表達量。重復3次，取平均值。

2 結果

CC癌組織與癌旁正常組織中DAPK3 mRNA的相對表達量分別為0.62±0.19、1.75±0.46，癌組織中DAPK3的相對表達量明顯低于癌旁組織(t=26.271，P<0.05)。

DAPK3 mRNA表達與CC患者腫瘤FIGO分期、分化程度有關(P均<0.05)，而與患者年齡、病理類型、腫瘤浸潤深度及是否伴淋巴結轉移無關(P均>0.05)，見表1。

表1 不同病理參數的CC患者宮頸癌組織中 DAPK3 mRNA 相對表達量比較

93例CC患者共隨訪1～60個月，中位隨訪時間47.2個月，隨訪期間無失訪病例，隨訪期間死亡25例。以DAPK3 mRNA相對表達量平均數0.62為臨界值，分為高DAPK3 mRNA表達者46例、低DAPK3 mRNA表達者47例，低DAPK3 mRNA表達者5年總體生存率(OS)為60.9%(28/46)，顯著低于高DAPK3 mRNA表達者5年OS 85.1%(40/47)(χ2=3.984，P=0.041)。

3 討論

CC是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，發病率占所有惡性腫瘤的13%[8]，女性腫瘤發病率僅次于乳腺癌。目前CC的主要治療方式包括手術治療、化療、放療及聯合治療等，但對于晚期轉移性患者治療效果差，部分患者藥物治療不敏感或接受治療一段時間后腫瘤出現耐藥，嚴重影響患者生活質量及長期生存[9]。因此，有必要深入研究CC的發病機制，尋找有意義的診斷治療靶點。腫瘤的發生是遺傳因素和環境因素共同作用的結果，腫瘤的發生發展是一個多步驟的發展過程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活及基因表達調控失常等，進而引起細胞內絲裂原活化的蛋白激酶途徑、Wnt通路等細胞信號傳導通路異常活化，導致細胞獲得無限增殖、轉移、促血管生成及免疫逃逸等腫瘤學特征[10]。

DAPK3基因編碼蛋白具有絲蘇氨酸蛋白激酶的活性，參與細胞內的各種信號傳導的激活。近年來研究報道，DAPK3是一種生長抑制性因子，如在3D形態發生模型中，通過慢病毒介導的敲除DAPK3表達后，腺泡細胞增殖加快，凋亡減少，腺泡大小增大，并且保持良好的腺泡極性[11]。此外，在子宮內膜癌的研究中發現DAPK3表達降低能夠激活癌基因c-myc的表達，促進腫瘤的惡性進展，與患者不良預后有關[11]。本研究中，CC癌組織中DAPK3 mRNA相對表達量低于癌旁正常組織，表明CC癌組織中DAPK3 mRNA表達下調，其機制可能與腫瘤發生時DAPK3基因啟動子區的表觀遺傳學修飾有關。研究[12]表明，腫瘤細胞中DAPK3基因啟動子區CpG島處存在高甲基化的現象，DAPK3基因啟動子區的甲基化修飾導致基因表達沉默。此外，尚有研究[13]表明腫瘤中DAPK3 基因存在T112M、D161N及P216S的非同義點突變，三種突變均降低或消除其激酶活性，功能喪失突變可促進細胞存活、增殖、細胞聚集和對化療的抵抗力。本研究中，FIGO分期Ⅱ～Ⅲ期、低分化患者癌組織中DAPK3 mRNA相對表達量明顯較低，表明DAPK3 mRNA表達與腫瘤FIGO分期、腫瘤分化程度有關。其機制一方面可能是DAPK3表達降低后，結果對miR-17/20a表達的促進作用減弱，miR-17 / 20a降低后，導致E2F等細胞周期相關轉錄因子表達增加，促進腫瘤細胞惡性增殖，腫瘤分期升高[14]。另一方面，腫瘤細胞中AKT信號通路激活，對DAPK3表達具有負向調控作用的同時[15]，AKT同時激活上皮間質轉化信號通路的關鍵轉錄因子TWIST等，導致腫瘤細胞分化程度降低，腫瘤分級越低[16]。因此，DAPK3可能參與CC發生發展的過程，與患者生存預后有關。本研究中進一步分析不同DAPK3表達水平患者5年總體生存率的差別，結果表明低表達組患者5年總體生存率明顯較差，表明CC癌組織中DAPK3的表達水平可能有助于判斷患者生存預后，有可能成為CC患者預后評估的腫瘤標志物。但目前CC癌組織中DAPK3表達的具體作用機制尚不明確，有待深入研究，尋找有效的臨床診斷和治療的治療方案。

綜上所述，CC癌組織中DAPK3 mRNA表達降低，DAPK3 mRNA表達與CC患者腫瘤FIGO分期、腫瘤分化有關，低表達DAPK3與患者的不良生存預后有關。DAPK3可能參與了CC的發生、發展。DAPK3可能成為新的CC診斷、治療及預后評估的腫瘤標志物，但其具體作用機制尚有待深入研究。