腹腔注射并飲服海藻糖的糖尿病小鼠腎功能、腎組織結(jié)構(gòu)及凋亡自噬相關(guān)蛋白表達(dá)觀察

游秀芳，劉宇寧，周治文，查文良，鄭萍

1咸寧市中心醫(yī)院(湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院),湖北咸寧437100；2湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病(DM)可導(dǎo)致微血管病變，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是造成我國終末期腎病(ESRD)的常見原因[1]。與非糖尿病ESRD患者相比，糖尿病ESRD患者的病死率相對(duì)較高[2]。可有效防治DN病情進(jìn)展的藥物研發(fā)是目前的研究熱點(diǎn)。海藻糖(Trehalose，TLS)由兩個(gè)D-葡萄糖分子的1，1鍵連接[3]，是一種天然存在的非還原性二糖，廣泛存在于多種有機(jī)體中，如細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、無脊椎動(dòng)物以及植物中，雖然哺乳動(dòng)物中不存在TLS，但TLS酶在人類腸道及腎臟組織中存在表達(dá)。TLS能穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)變性，冷凍儲(chǔ)存時(shí)加入TLS可穩(wěn)定肉的組織結(jié)構(gòu)，有助于保留營養(yǎng)和維生素[4]。海藻糖可作為自噬誘導(dǎo)劑，對(duì)各種疾病如帕金森疾病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥以及胰島素抵抗所致的心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[5]。然而，TLS對(duì)DN腎組織的相關(guān)作用未見報(bào)道。2018年3月～2019年5月，本研究采用鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)建立DM小鼠模型，觀察TLS腹腔注射并飲服對(duì)DM小鼠腎臟組織的保護(hù)作用，并探討其可能作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑及儀器 SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠 60只，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018，體重20～25 g，12 h晝夜節(jié)律燈照，相對(duì)濕度45%～60%，室溫20 ℃～25 ℃，通風(fēng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。TLS(購自武漢漢宇飛揚(yáng)科技有限公司)，STZ(美國Sigma公司)，尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)、尿酸(uric acid，UA)試劑盒購自武漢生之源生物科技股份有限公司，血糖試紙與血糖儀(長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司)。凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3以及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p62、LC3B抗體購自美國Cell signaling公司。其余均為進(jìn)口或者國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。3-18K高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)，JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，LEICA RM2235病理切片機(jī)(德國Leica公司)，KD組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，HT7700透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。

1.2 分組、DM模型制備及TLS干預(yù)方法 小鼠60只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組(DM組)、TLS正常對(duì)照組(TLS組)、TLS糖尿病模型治療組(DM+TLS組)各15只，DM組、DM+TLS組小鼠腹腔注射STZ(PH4.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解配制成0.5%的STZ溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光于冰上操作，15 min內(nèi)使用完畢)，50 mg/(kg·d)，連續(xù)5 d,制作DM模型。正常對(duì)照組小鼠連續(xù)5 d注射等容量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。給藥后3、7 d測定各組隨機(jī)血糖，造模成功標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)2次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L。造模成功后，DM+TLS組、TLS組腹腔注射TLS，1 mg/(kg·d)，連續(xù)注射2 d,隨后2%濃度的TLS飲水給藥，自由飲水，連續(xù)干預(yù)24周。DM組與正常對(duì)照組小鼠均腹腔注射等量超純水，連續(xù)2 d,后飼養(yǎng)期間正常飲水。

1.3 各組小鼠隨機(jī)血糖及眼球血清BUN、Cre、UA檢測 干預(yù)24周時(shí)取各組小鼠，血糖儀檢測隨機(jī)血糖，稱量體重后麻醉，摘除眼球取血，超速離心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)后取血，上清液全自動(dòng)生化分析儀檢測血清BUN、Cre、UA。

1.4 各組小鼠腎臟臟器系數(shù)測算及腎臟組織結(jié)構(gòu)觀察 處死各組小鼠，取其雙側(cè)腎臟，生理鹽水洗凈后稱重，根據(jù)公式：腎臟臟器系數(shù)=(腎臟絕對(duì)重量/體重)×100%，測算小鼠腎臟臟器系數(shù)。將腎臟組織置于4%甲醛溶液中，石蠟包埋切片后光鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)。

1.5 各組小鼠腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3以及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p62、LC3B檢測 采用Western blotting法。取各組100 mg腎臟組織，冰上裂解勻漿，BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)不同抗體的效價(jià)，加入用TBST適當(dāng)稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔的IgG抗體，室溫孵育1 h后加入ECL熒光液，顯影。Image-J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值之比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠隨機(jī)血糖及眼球血清BUN、Cre、UA水平比較 結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠隨機(jī)血糖及眼球血清BUN、Cre、 UA水平比較

2.2 各組小鼠體重、腎臟重量及腎臟臟器系數(shù)比較及腎組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化 各組小鼠腎臟臟器系數(shù)比較見表2。HE染色光鏡下可見正常對(duì)照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完好；DM組小鼠可見部分腎小管細(xì)胞呈氣球樣變，基底膜明顯增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張；DM+TLS組腎小球系膜增厚不明顯，腎小管細(xì)胞無明顯氣球樣變。

表2 各組小鼠體重、腎臟重量及腎臟臟器系數(shù)比較

2.4 各組小鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3、Beclin-1、p62、LC3B相對(duì)表達(dá)量比較 各組小鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較見表3，各組小鼠腎臟組織Beclin-1、p62、LC3B相對(duì)表達(dá)量比較見表4。

表3 各組小鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3 相對(duì)表達(dá)量比較

表4 各組小鼠腎臟組織Beclin-1、p62、LC3B 相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

DN是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一。調(diào)查研究中國住院的糖尿病患者中，DN患病率約33%，其中早期腎病占18.0%，臨床腎病占13.2%，腎功能不全占5.3%，尿毒癥占1. 2%[7,8]。DN已成為我國終末期腎功能衰竭的主要原因之一，糖尿病引起的腎損傷是導(dǎo)致終末期腎功能不全的主要原因，并且形勢(shì)越發(fā)普遍[9]。

糖尿病動(dòng)物模型的建立可分為兩種：一是自發(fā)性糖尿病模型；二是誘發(fā)性糖尿病模型，如通過腹腔注射STZ、四氧嘧啶引起胰島β細(xì)胞損傷，造成血糖升高。一次性大劑量注射STZ實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高，連續(xù)小劑量注射STZ破壞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰島細(xì)胞更穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)5 d給C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ，小鼠造模一周后開始出現(xiàn)血糖升高、多尿、多飲食、多飲水、體重減輕等癥狀。

DN的病理基本特征有系膜基質(zhì)合成增多，腎小球基底膜厚度增加，因此會(huì)引起腎小球硬化和腎小球間質(zhì)出現(xiàn)纖維化病變[10]。本實(shí)驗(yàn)中DM組小鼠明顯可見腎小管細(xì)胞呈空泡樣變性，基底膜出現(xiàn)明顯增厚現(xiàn)象；TLS給藥后可顯著減輕糖尿病小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)損傷癥狀，維持腎組織基本結(jié)構(gòu)完整。DN引起的腎臟纖維化，最終可致腎小管間質(zhì)損傷和腎小球?yàn)V過率逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DM組小鼠小鼠眼球血BUN、Cre以及UA含量明顯增加，腎功能水平降低，說明TLS在一定程度上改善糖尿病所致的腎功能減退。以上結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠出現(xiàn)腎臟損傷，而TLS能夠改善DN小鼠腎功能代謝異常，對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用。

DN的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，現(xiàn)有研究認(rèn)為糖脂代謝異常、氧化應(yīng)激水平增加、腎小管上皮細(xì)胞或者足細(xì)胞的凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[12]。因此，在DN的治療中，靶向抑制細(xì)胞凋亡的藥物備受關(guān)注。細(xì)胞凋亡主要由凋亡誘導(dǎo)基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同調(diào)控，Bax/Bcl-2比例失衡可激活下游Caspase 信號(hào)通路從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，最終引發(fā)功能障礙。為了更好地闡明 TLS抑制DN小鼠腎組織中細(xì)胞的凋亡作用，我們進(jìn)一步檢測了腎臟組織中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中具有重要作用的抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase家族蛋白水平。研究發(fā)現(xiàn)TLS可有效抑制DN小鼠腎組織Bax、Caspase-1、Caspase-3水平同時(shí)升高Bcl-2的表達(dá)，TLS可能通過抑制細(xì)胞凋亡從而對(duì)DN小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

自噬廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，受嚴(yán)格調(diào)節(jié)的溶酶體依賴性降解途徑，主要負(fù)責(zé)長壽命蛋白和細(xì)胞器的批量降解，與細(xì)胞存活、分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬的調(diào)控異常參與了DN的病理生理進(jìn)程[13]，調(diào)控自噬有望成為DN防治的新靶標(biāo)。Beclin-1 是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，也是Ⅲ類PI3K蛋白激酶的核心復(fù)合物，通過募集多個(gè)自噬相關(guān)蛋白啟動(dòng)自噬[14]。胞漿型 LC3Ⅰ 向脂質(zhì)化LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化標(biāo)志著自噬體的形成，故LC3Ⅱ公認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)自噬活性的早期標(biāo)志蛋白[15]。P62(SQSTM1)能和 LC3Ⅱ相互作用，隨后與其結(jié)合的泛素化蛋白或細(xì)胞器被包裹入自噬體后降解，其水平與細(xì)胞內(nèi)自噬活性成反比，常用于檢測自噬流。已有研究[16]表明TLS是mTOR非依賴型自噬誘導(dǎo)劑，TLS通過增加細(xì)胞自噬小體數(shù)量和自噬標(biāo)記蛋白表達(dá)一定程度逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性病癥，延緩發(fā)病，延長壽命；此外，海藻糖逆轉(zhuǎn)基因敲除所致的胰島素抵抗小鼠自噬標(biāo)記蛋白Atg5，LC3-II表達(dá)水平降低從而改善心肌收縮功能障礙[6]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠腎臟組織中P62水平升高而Beclin-1、LC3Ⅱ水平降低，提示糖尿病狀態(tài)下腎臟自噬水平降低；給予TLS治療后糖尿病小鼠腎臟的自噬水平升高，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TLS可能通過激活自噬從而抑制DM的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，TLS腹腔注射并飲服對(duì)DM小鼠腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用，其機(jī)制可能為TLS降低Bax、Caspase-1、Caspase-3及P62表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2、Beclin-1及LC3B表達(dá)。通過激活腎臟自噬、抑制凋亡發(fā)生從而對(duì)糖尿病小鼠腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用，本研究將為臨床防治DN提供新的解決思路，也為尋求開發(fā)有效抗DN的新藥物和靶點(diǎn)奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。