重組大腸桿菌表達17β-羥基類固醇脫氫酶全細胞催化合成寶丹酮的研究

吳玉玲，邵明龍，周武林，高惠芳，張顯，徐美娟，楊套偉，饒志明

（江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

引 言

寶丹酮（boldenone，BD）是一種蛋白同化類固醇，可增加食欲，促進蛋白質合成，支持氮保留并刺激腎臟中促紅細胞生成素的釋放，多用于獸醫和肉類生產行業[1]。在傳統的類固醇制藥行業中，寶丹酮主要由1,4-雄烯二酮（ADD）經過多步化學反應合成[2]。近年來，寶丹酮的生物方法合成以其溫和的反應條件和環保優勢引起了諸多關注。Chen 等[3]構建了重組P.pastorisGS115，實現了從雄烯二酮（AD）到ADD 和寶丹酮的生物轉化，Eisa 等[1]發現Pseudomonas aeruginosa能以玉米油植物甾醇為底物，轉化生成AD、睪酮和寶丹酮。Tang 等[4]通過重組M.neoaurum和P.pastoris的半連續發酵，以植物甾醇為底物，合成了ADD 和寶丹酮。但是由于轉化率不高，存在副產物，或者轉化過程復雜，對寶丹酮的生產造成一定的困難。

目前，已發現部分微生物含有17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD），可以催化類固醇的17β 還原反應。在體外，大多數17β-HSD 酶可以催化不同類固醇的17β 還原/氧化之間的可逆反應[5-10]（圖1）。但是，不同來源的17β-HSD，在催化17β 位點的還原和氧化方向上具有不同的催化效率[8,11]，Fernández-Cabezón 等[12]將 來 源 于 睪 丸 酮 叢 毛 單 胞 菌（Comamonas testosteroni）和 月 狀 旋 孢 腔 菌（Cochliobolus lunatus）的17β-HSD進行異源表達后，發現其具有C-17 還原活性，能以AD 為底物，催化其C-17 的C O 還原生成C—OH 的反應。但是由于轉化率較低，限制了17β-HSD的工業應用。

圖1 17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD）生物催化ADD合成BDFig.1 Bioconversion of ADD to BD by 17β-hydroxysteroid dehydrogenase(17β-HSD)

本研究將以此為基礎，通過同源分析和序列比對，找到不同來源的17β-HSD，對其是否具有C-17還原活性進行分析，以期篩選到能催化ADD 還原生成寶丹酮的17β-HSD。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因、引物、質粒和菌株 本實驗所用到的六個17β -HSD 基因分別來源于Cochliobolus lunatus,Pyrenochaetasp.,Beauveria bassiana,Arthroderma otae,Comamonas testosterone和Burkholderiasp.，經過大腸桿菌密碼子優化后，由金唯智合成并連接到pUC57 質粒上，本實驗所有的菌株、質粒和引物見表1。

1.1.2 主要試劑 ADD，寶丹酮標準樣品購于上海Sigma-Aldrich；羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）購于山東濱州智源生物科技有限公司；DNA 聚合酶，T4 DNA 連接酶和限制性核酸內切酶購于大連寶生物生物工程有限公司；用于DNA 片段純化和質粒提取的mini DNA 快速純化試劑盒和質粒miniprep 試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司。其他試劑為進口或國產分析純及更高。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀：德國Eppendorf 公司；UVP 凝膠成像儀：上海天能；核酸電泳系統：北京市六一儀器廠；蛋白電泳系統：美國Bio-Rad 公司；賽默飛U3000 高效液相色譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.4 培養基 LB液體培養基（g·L-1）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；LB 固體培養基（g·L-1）：在LB 液體培養基的基礎上加2%的瓊脂粉；根據具體情況添加抗生素，卡那霉素的工作濃度為20 μg·ml-1。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建 本實驗所用到的質粒如表1，進行密碼子優化后的17β-HSD 基因合成并克隆到了質粒pUC57-HSD 上。為了構建在大腸桿菌中表達的重組質粒，以不同的pUC57-HSD 質粒用作模板，將特異的-F(HSD)/-R(HSD)用作引物，并將獲得的PCR 片段進行凝膠純化后，用連接酶連接至pET-28a(+)載體的BamH Ⅰ/Hind Ⅲ限制性核酸內切酶位點。表1中顯示了6種17β-HSD 基因的特異性-F(HSD)/-R(HSD)引物。然后將這些重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，以構建重組菌株BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDPy、 BL21/pET28a-HSDBb、 BL21/pET28a-HSDAo、 BL21/pET28a-HSDCt 和BL21/pET28a-HSDBu，并 通 過DNA測序驗證。

表1 本研究所用到的菌株、質粒及引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2.2 17β-HSD 在大腸桿菌中的表達和純化 將活化后的重組菌株BL21/pET28a-HSD 接種到50 ml LB，于37℃，200 r·min-1培養，當細胞在600 nm 的光密度（OD600）達到0.6～0.8 時，以0.5 mmol·L-1的終濃度添加IPTG 以誘導蛋白質表達。在25℃下繼續培養12 h后，在4℃下以8000 r·min-1離心5 min收獲細胞，并用10 ml 磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）洗滌3 次。然后將細胞重懸于5 ml 磷酸鹽緩沖液中進行超聲處理。超聲處理后，以8000 r·min-1的速度離心30 min，從混合物中獲得粗酶，并將其用于后續研究，包括純化和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白分析。以HisTrapTMHP 親和層析柱[13]中所述的方法進行純化，純化后的蛋白用于酶活力測定和酶學性質分析。以Bradford 法和牛血清白蛋白為標準品測定蛋白濃度[14]。

1.2.3 17β-HSD 酶活性測定和酶學性質分析 用高效液相色譜法（HPLC）檢測17β-HSD 活性，測量轉化過程中寶丹酮的形成速率。反應體系（5 ml）含有50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），200 μmol·L-1ADD（預溶于2%甲醇），0.5 mmol·L-1NADPH 和適當濃度的純化酶。一個單位活性定義為在37℃和pH 7.5 下1 min 內能夠將1 μmol·L-1ADD 轉化為寶丹酮的17β-HSD 量。HSDPy 分別在不同pH（pH 4～6，50 mmol·L-1Na2HPO4-檸檬酸緩沖液；pH 6～8，50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液；pH 8～10，50 mmol·L-1Na2CO3-NaHCO3緩沖液），不同溫度（20～50℃，每隔5℃為一個梯度，以及37℃）以及不同金屬離子和EDTA（在反應體系中分別添加K+、Na+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、EDTA，終濃度為1 mmol·L-1）條件下反應，以測定不同反應條件對HSDPy酶活性的影響。

1.2.4 重組菌株BL21/pET28a-HSD 對ADD 的全細胞轉化 重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSD 菌株在搖瓶中于37℃，200 r·min-1生長，在25℃誘導12 h后，將50 ml 培養物于8000 r·min-1離心5 min，并用50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）洗滌三次以收獲細胞。然后將細胞重懸（如不特殊說明，細胞干重23 g·L-1）于含有ADD（如不特殊說明，底物濃度為1 g·L-1）的50 ml 磷酸鹽緩沖液（50 mmol·L-1，pH 7.5）中。細胞干重測量方法：取1 ml 細胞培養液，于13000 r·min-1，離心5 min 后去除上清液，于80℃下烘干，24 h后稱量細胞干重。在以前的研究中，HPβ-CD 是ADD 生物轉化的最佳助溶劑，ADD 與HPβ-CD 的最佳摩爾比為1∶1[15]。因此，本研究中使用了相同的比例添加助溶劑。對全細胞轉化的不同生物量（9、18、27、36、45 g·L-1）和底物濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L-1）進行了研究。在5 L 發酵罐中進行的全細胞轉化的反應體系為2 L。于37℃，200 r·min-1條件下進行全細胞生物催化。從反應混合物中每隔一定時間取出1 ml 樣品，經過乙酸乙酯充分萃取之后，用于HPLC分析。

1.2.5 分析方法 從反應液中取出1 ml 樣品，將樣品置于沸水浴10 min 終止反應，用4 ml 乙酸乙酯充分萃取。 離心后，取1 ml 上層溶液通過ThermoFisher HPLC 分析，色譜柱為Diamonsil C18（2），5 μm，250 mm×4.6 mm，檢測器為紫外檢測器。在254 nm 處檢測到ADD 和寶丹酮，流動相由甲醇和水（70∶30,體積比）組成。流速為1 ml·min-1，柱溫為30℃[16]。

2 實驗結果與討論

2.1 17β-羥基類固醇脫氫酶基因的篩選

在目前關于甾體17β-還原的研究中，發現了具有17β-還原活性的菌株，但是由于存在活性不高、缺乏對編碼17β-HSD 基因的鑒定和對相應蛋白質的純化和活性分析等問題[1,3,11,17-18]，限制了甾體藥物的大規模生產。需要進一步豐富酶資源，以及選取合適的宿主進行表達，實現寶丹酮的經濟高效合成[19]。以成功表達甾體17β還原活性的酶[12]為基礎，根據其氨基酸序列，跨種屬地在多種分枝桿菌、紅球菌等宿主間，以及原核和真核生物間，進行了17β-HSD 序列的同源性分析和序列比對[20]，結果如圖2所示。

由圖可知，來源于Cochliobolus lunatus、Comamonas testosterone和Mycobacterium neoaurumVKM Ac-1815D 的17β-HSD 分別被分到三個獨立的簇。對序列的結構域進行分析[21]，發現大多數17β-HSD 屬于短鏈脫氫酶家族，具有一段輔因子結合特征序列TGXXXGXG 或TGXXGXXG 和活性位點特征序列YXXXK。分別選取了來源于真菌Cochliobolus lunatus（GenBank ID：AAR04485.1），Pyrenochaetasp.（GenBank ID：OAL44739.1，同源性96%） ，Beauveria bassiana（GenBank ID：XP_002844741.1，同 源 性 93%），Arthroderma otae（GenBank ID：XM_002844695.1，同源性80%）和來源 于 細 菌Comamonas testosterone（GenBank ID：CAA44977.1） ，Burkholderiasp. （GenBank ID：SIO70547.1，同源性48%）的六種不同17β-HSD，用于進行下一步研究。由于大腸桿菌表達系統具有遺傳背景比較清楚、培養周期短、目標基因表達水平高等優勢，將這六種不同17β-HSD 在大腸桿菌中進行了異源表達，以驗證它們是否能夠成功地表達生物學活性[22]。

圖2 17β-HSD的同源性分析和序列比對Fig.2 Homology analysis and sequence alignment of 17β-HSD

2.2 重組17β-HSD的構建表達和活性分析

由于難以從天然來源直接獲得高效表達17β-HSD 的菌株，因此嘗試使用大腸桿菌作為表達宿主通過DNA 重組技術，異源過表達17β-HSD[23-25]。根據1.2.1 節中的方法，進行重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSD 的構建，PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳，顯示目的基因的條帶大小約為820 bp，重組質粒經過BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進行單雙酶切驗證，結果如圖3 所示。由圖可知，兩個目的條帶的大小分別約為5.40 kb 和820 bp，表明目的基因成功連接到pET28a(+)載體上，測序結果也表明各個重組pET28a-HSD質粒構建成功。

按照1.2.2 節所述的方法對重組蛋白進行誘導表達以及SDS-PAGE 分析，結果如圖4 所示。由圖可知，目的蛋白條帶約在30×103處，與預期的目的17β-HSD 蛋白大小一致，可以初步確認各個17β-HSD在大腸桿菌BL21中實現了表達。

圖3 重組質粒pET28a-HSD酶切驗證Fig.3 Identification of recombinant pET28a-HSD by enzyme digestion

六種重組17β-HSD 在大腸桿菌中成功表達之后，為了進一步分析各種不同17β-HSD 在重組大腸桿菌中的活性，考察了各個重組BL21/pET28a-HSD對底物ADD 的轉化情況，結果如表2。發現BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDPy 和 BL21/pET28a-HSDBb 具有17β-還原催化的活性，在轉化過程中生成了寶丹酮，其中BL21/pET28a-HSDPy 對ADD的轉化率最高，在12 h內轉化1 g·L-1ADD生成了0.72 g·L-1寶 丹 酮，比BL21/pET28a、BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDBb、 BL21/pET28a-HSDAo、BL21/pET28a-HSDCt 和 BL21/pET28a-HSDBu 分 別 高 88.1%、24.3%、68.1%、86.0%、87.1%和87.5%。這些結果表明HSDPy 具有更高的催化潛力，因此對其酶學性質進行了進一步的研究。

2.3 重組酶HSDPy的酶學性質分析

圖4 重組大腸桿菌17β-HSD SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of 17β-HSD expression in recombinant E.coli

表2 重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSD轉化ADDTable 2 Conversion of ADD by recombinant E.coli BL21/pET28a-HSD

圖5 pH（a）和溫度（b）對HSDPy酶活性的影響Fig.5 Effects of pH(a)and temperature(b)on activity of HSDPy

圖6 不同金屬離子及EDTA對HSDPy酶活性的影響Fig.6 Effect of different metal ions and EDTA on activity of HSDPy

將重組酶純化后，按照1.2.3 節的方法，分析了HSDPy的最適pH、最適溫度以及金屬離子對其酶活性的影響。如圖5、圖6 所示，重組HSDPy 的最適反應pH 為7.5，在最適條件pH 下，將純酶放置于不同的溫度下進行反應，然后檢測酶活性，以確定其最適反應溫度。結果表明，隨著反應溫度升高，HSDPy的相對酶活也逐漸提高，在溫度達到37℃時，重組酶的酶活力達到最高，然后隨著溫度的上升，酶活迅速下降。因此，可以確定重組HSDPy 在pH 為7.5條件下的最適反應溫度為37℃。該重組酶的最佳pH 和溫度與先前的研究一致[15]。在上述最適的反應pH 和溫度的條件下，在反應體系中添加不同的金屬離子和EDTA（終濃度為1 mmol·L-1），檢測相應的酶活，其中Na+、K+和EDTA 對重組HSDPy 的酶活性影響較小，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Fe2+使酶活顯著降低，Fe3+、Zn2+使酶失活。

2.4 重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 轉化ADD生產寶丹酮

根據2.2 節的結果，經過6 株重組菌對ADD 的轉化能力驗證和比較后，確定了重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 的催化活性最高，為了進一步提高寶丹酮的產量，對底物濃度、生物量等全細胞催化的條件進行了優化[15,26]。

生物量對生物轉化具有重要影響，在轉化過程中會影響底物的吸收和細胞的呼吸[27]。針對重組菌BL21/pET28a-HSDPy 不同生物量轉化ADD 生成寶丹酮的研究結果如圖7(a)所示。隨著生物量的增加，寶丹酮的產量也逐漸增加，在生物量達到36 g·L-1時，達到最大值，對應寶丹酮的產量為0.85 g·L-1。當生物量大于36 g·L-1時，ADD 的轉化率在12 h 內不再增加。轉化率降低的原因可能是高密度細胞抑制細胞傳質效率和細胞呼吸，進而降低了細胞對底物的利用。在重組大腸桿菌表達11β-羥基類固醇脫氫酶，催化氫化可的松合成為11β-氫化可的松的過程中，也出現了類似結果[28]。

由于ADD 難溶于水，在轉化過程中會限制重組菌對底物的利用[29]，過量的底物對細胞有毒害作用，因此將ADD 轉化為寶丹酮時需要在合適的底物濃度下進行。隨著底物濃度的增加，ADD 的轉化率逐漸增加，如圖7(b)所示。底物濃度超過2 g·L-1后，寶丹酮的產量不再提高，表明底物濃度為2 g·L-1的條件下，已經達到了最大的底物利用率。之后底物濃度再升高，寶丹酮的產量反而降低，可能是由于高濃度底物對17β-HSD活性的抑制作用[30]。

在上述最佳條件下，將重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 在5 L 發酵罐中進行了從ADD 到寶丹酮的轉化。如圖8(a)所示，生物轉化12 h 后，從2 g·L-1ADD 中獲得了1.46 g·L-1寶丹酮，在轉化過程中未檢測到副產物。由于大部分已鑒定的17β-HSD 可以催化可逆的氧化還原反應[6-7]，推測大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 無法將ADD 完全轉化為寶丹酮可能是因為存在可逆的反應。由于全細胞催化受到高濃度底物的限制，可以使用同一批生物催化劑通過分批補料策略來獲得更高的寶丹酮產量。

圖7 大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy的不同生物量（a）和不同底物濃度（b）對寶丹酮生產的影響Fig.7 Effects of different biomasses of E.coli BL21/pET28a-HSDPy(a)and substrate concentration(b)on BD production

圖8 分批轉化（a）和補料分批轉化（b）ADD合成寶丹酮的過程Fig.8 Batch conversion(a)and fed-batch conversion(b)of ADD to synthesize BD

補料分批轉化的結果如圖8(b)所示。生物轉化系統中ADD 的初始濃度為2 g·L-1，每12 h 將1.7 g·L-1ADD 補充到轉化系統中，以使生物催化反應在最佳底物濃度的條件下繼續進行。可以看出，在前兩批反應中，寶丹酮的產量穩定增加。但是，在第三批轉化過程中寶丹酮的生產率逐漸下降，這主要是由于高濃度產物的限制。在生物轉化38 h 后，從5.40 g·L-1ADD 中獲得了3.66 g·L-1寶丹酮，生產率為0.10 g·L-1·h-1，比優化之前（0.72 g·L-1、0.06 g·L-1·h-1）提高了60.5%，產量是優化之前的4.1倍。

總之，這些結果證明，通過補料分批策略對重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 進行全細胞生物催化可以實現較高的寶丹酮產量。此外，與甾醇的發酵生產相比，本研究所提出的生物轉化過程相對簡單，不需要無菌環境并且從轉化系統中純化寶丹酮也相對簡單。該研究為制藥工業中寶丹酮的生產提供了有前景的生物轉化系統和有效的方法。

3 結 論

本研究鑒定了來源于Pyrenochaetasp.的17β-HSD 具有較高的還原活性（對ADD 的轉化率為72%），研究了其酶學性質（最適pH 為7.5，最適溫度為37℃，以及除了Na+、K+，大部分金屬離子會抑制其活性）。

在大腸桿菌中以ADD 為底物實現了寶丹酮的生物合成，并且通過全細胞轉化條件優化（最佳轉化生物量為36 g·L-1和最佳底物濃度為2 g·L-1），以及分批補料策略（初始底物濃度2 g·L-1，補料兩次，共進行三批轉化），使寶丹酮的產量由最初的0.72 g·L-1提高到3.66 g·L-1，產量提高了4.1 倍。另外，在轉化過程中未檢測到副產物。

后續研究可通過構建輔酶循環體系（例如共表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶[15,31]，為反應提供可再生的還原力）進一步提升寶丹酮的產量。還可通過更換底盤細胞（如以釀酒酵母為底盤細胞[32-34]，利用葡萄糖為底物合成寶丹酮）進一步降低生產的成本。

本研究提供了一種在單次生物轉化中獲得寶丹酮的有效方法，為生物合成寶丹酮提供了可能。