離子液體-微波輔助從黃連提取小檗堿的實驗與分子模擬

吳玉花，丁欣，李小露，高紅鳳，馮煒，白紅存，郭慶杰

（寧夏大學化學化工學院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，化學國家級實驗教學示范中心，寧夏 銀川750021）

引 言

從黃連中高效提取獲得小檗堿等生物活性物質對于中藥資源有效利用具有重要意義[1-2]。早在數千年前的古代中國，人們已經發現黃連（一種多年生草本植物）可作為清熱解毒和抗感染藥物主治腸道細菌感染等疾病。近代臨床藥理學研究發現黃連還具有抗心律失常、降血糖、降血脂、抗癌、抗病毒等藥理作用，可用于心律失常及病毒性心肌炎、心力衰竭、高脂血癥、癌癥等的治療。現代醫藥學研究表明，黃連所表現出來的臨床藥用價值與其根部所含的異喹啉類生物堿密切相關[2-3]。黃連中的生物堿成分包括黃連堿、巴馬丁、藥根堿、小檗堿、表小檗堿等，具有重要的藥用價值。然而，黃連中所發現的生物堿大部分為異喹啉類，化學結構相似性較高，理化性質也較為相近，導致高效提取難度增大[1-2]。

小檗堿是從黃連諸多生物堿成分中可獲得的含量最高的一種，其高效提取具有重要學術和應用價值。目前由黃連中提取小檗堿常用方法包括稀硫酸滲漉法、乙醇回流提取法、超聲提取法、連續回流法、煎煮法等工藝[4-6]。然而，這些方法具有耗時較長、操作復雜、效率低等缺點，而且所用試劑對環境不友好，難以滿足綠色化工提出的高效、可持續發展理念。

離子液體作為綠色介質具有液態范圍寬、揮發性小、蒸氣壓低、溶解能力強、無味、無污染、不易燃、易與產物分離、易回收、可反復循環使用等優良性能，在反應溶劑、催化、吸附與分離等領域表現出優異性能[7-10]。隨著生成成本的不斷降低，離子液體在天然活性物質提取中顯示出良好的前景。Duan等[11]采用離子液體負壓空化輔助方法從木豆根中提取三種主要黃酮類化合物，并實現中試級別應用。Li等[12]基于離子液體水溶液超聲輔助方法研究了黃柏中三種生物堿提取。李明英[13]對近年來離子液體在天然活性物質提取中的應用進行了研究進展的綜述和展望。另一方面，微波作為一種新的輔助手段，因萃取速度快、效率高、選擇性好等特點而受到廣泛關注[14]。最初微波技術主要用于無機分析中的樣品預處理，后期逐漸將其應用到有效成分提取。利用微波加熱可加速強化溶劑對固體樣品中的目標提取物尤其天然有機化合物的提取。將微波法應用到天然藥物有效成分的提取，更有利于對藥物活性成分的分析及研究。近年來，利用微波能量從天然產物中提取重要成分受到了研究人員的重視[15-18]。特別是利用離子液體和微波輔助方法在天然產物有效成分提取的報道逐年增多。李攻科等[17]以離子液體的水溶液為提取劑，通過微波輔助法對石蒜中的石蒜堿、力克拉敏和加蘭他敏生物堿等物質的提取進行了研究。發現相較于傳統加熱回流和其他溶劑萃取，離子液體溶液微波輔助萃取具有快速、高效、無環境污染的優點。Lu 等[18]采用微波輔助提取法，以1-烷基-3-甲基咪唑為陽離子的離子液體-水溶液為提取劑，對蓮子心中酚醛堿提取進行了研究，發現與傳統提取法和一般溶劑微波提取法相比，離子液體微波輔助方法快速高效，且具有較高提取率。

本研究以黃連為研究對象，采用離子液體-微波輔助聯合方法，提取有效成分小檗堿，實現提取的高效過程強化。研究以離子液體-水溶液為溶劑的微波輔助提取法，考察微波時間、操作溫度、溶液pH 等工藝條件以及離子液體種類選擇等對提取收率的影響。基于現代密度泛函理論的分子模擬，研究微波外場和不同離子液體與小檗堿的相互作用，揭示復合體系組分之間相互作用的物理本質。

1 實驗與計算模擬

1.1 試劑與儀器

主要試劑：黃連購自寧夏藥材公司；鹽酸小檗堿標準品購自中國食品藥品檢定研究院；[EMIM]Ac、[BMIM]Ac、[HMIM]Ac、[OMIM]Ac、[DMIM]Ac 五種咪唑類離子液體購自中國科學院蘭州化學物理研究所，純度>99%；乙腈（色譜純）和磷酸（分析純）均購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

主要儀器：微波合成儀（MAS-II 型），上海新儀微波化學科技有限公司；數顯電動離心機（80-4型），常州國華；微型植物粉碎機（FZl02 型），北京中興偉業儀器有限公司；酸度計（PB-10型），北京賽多利斯科學儀器有限公司；高效液相色譜儀（1100型），美國安捷倫公司；計算服務器，雙路Intel 志強E5-2600V3系列。

1.2 實驗方法

離子液體-微波輔助萃取：將干燥塊狀黃連粉碎研磨，過100 目（149 μm）篩，置于棕色磨口瓶備用。使用分析天平準確稱量約0.2 g黃連粉末，置于三頸瓶中。向其中加入一定量萃取溶劑，在微波反應器內，待設定完功率、溫度、時間后，在磁力攪拌下進行提取。完成后靜置冷卻至室溫，離心10 min，使用0.45 μm 濾膜過濾。取一定量上清液定容到50 ml容量瓶中配制待測液，并使用高效液相色譜法（HPLC）測定其中含量。研究中首先進行單因素實驗的考察，在此基礎上確定較優提取工藝。

在上述實驗條件下小檗堿以鹽酸鹽形式存在。使用HPLC 檢測鹽酸小檗堿含量最佳條件為：流動相為磷酸二氫鈉溶液(濃度0.05 mol/L，pH=2.5)和乙腈體積比為70:30；固定相為C18柱；柱溫25℃；波長264 nm。在HPLC 譜圖中鹽酸小檗堿出峰時間約為11.6 min，此時能得到很好鹽酸小檗堿的分離。使用鹽酸小檗堿標準品配制系列不同濃度的溶液并進色譜柱，測定峰面積，繪制標準曲線，回歸方程為y=1001.10x+10.49，R2>0.9999。根據標準曲線即可獲得不同提取液中鹽酸小檗堿的含量。

小檗堿的提取收率（yield，mg/g）在本研究中定義為：

式中，m*(mg)和m0(g)分別為HPLC 測定的待測液中鹽酸小檗堿質量和黃連樣品質量；V0和V1分別為提取液定容體積和待測提取液體積，ml。

1.3 分子模擬方法

分別構造小檗堿和離子液體單獨模型以及復合體系模型。利用密度泛函理論（DFT）在M06-2X/6-31G**基組水平上分別對單獨體系和復合體系進行幾何構型全優化，并進行能量和電子性質計算，所有計算均使用Gaussian16程序完成。需要指出的是，DFT 方法中常規的廣義梯度泛函（如PBE、BP86、PW91等）和一般雜化泛函(如B3LYP 和PBE0等) 方法不能較為精確地描述弱相互作用體系，而本研究使用M06-2X 方法[19-21]被證明對于非共價相互作用的描述甚至能夠接近非常精確的耦合簇(CCSD)方法[22]。本研究中分子模擬計算中使用外加電場方式模擬微波行為。這是當前模擬計算微波外場的常用方法，并得到了較為廣泛的認可[14,23-24]。為了更深入研究離子液體和小檗堿之間的相互作用本質，對復合體系的約化密度梯度（RDG）[25-26]進行了分析和討論。

2 實驗結果與討論

2.1 不同離子液體的影響

本研究選取[EMIM]Ac、[BMIM]Ac、[HMIM]Ac、[OMIM]Ac、[DMIM]Ac 五種常用離子液體用于從黃連中提取小檗堿。在離子液體濃度0.5 mol/L、固液比1∶70（質量(g)∶體積(ml),下同）、溶液pH=4、微波時間8 min、提取溫度60℃和微波功率300 W 的相同工作條件下，獲得不同離子液體微波輔助從黃連中提取小檗堿的收率如圖1 所示。由圖可見，五種離子液體水溶液用于從黃連中提取鹽酸小檗堿收率達到30.6～58.9 mg/g。根據報道[27]，不同黃連樣品中小檗堿含量約為7%。本研究最優工藝下收率為58.9 mg/g，按此計算提取率可達到84%。與其他條件相同而水溶液中不加離子液體的提取收率25.3 mg/g 相比，離子液體的加入使得小檗堿提取收率顯著提升。可見，離子液體對于從黃連中提取小檗堿具有明顯的過程強化作用。

圖1 不同離子液體條件下提取收率Fig.1 Extraction yield by different ionic liquids

圖2 咪唑類離子液體的陽離子分子結構Fig.2 Molecular structures for imidazole cation of ionic liquids

不同種類的離子液體表現出不同程度的提取收率提升效果。所選用的五種陰離子為醋酸根的離子液體中，[OMIM]Ac的提取效果明顯優于其他離子液體。這可能與不同種類的離子液體自身結構和性質具有一定關聯。從分子結構的角度考慮，本研究所考察的五種離子液體均為甲基咪唑醋酸鹽類。它們具有相同的陰離子結構，主要差異在于陽離子中咪唑環取代烷基中碳鏈的長度不同（圖2）。當離子液體陽離子取代烷基中碳鏈長度從C2 乙基逐漸增加至C6 己基時，提取收率由30.6 mg/g 增加至34.1 mg/g，呈現小幅增加趨勢。當取代烷基碳鏈進一步延長至C8辛基時，提取收率迅速增加達到峰值（58.9 mg/g）。隨后，當取代烷基碳鏈長度進一步增加到C10 癸基時，提取收率降低至39.5 mg/g。可見，離子液體陽離子取代烷基中碳鏈的長度對于提取收率的確具有重要影響。從微觀分子構效關系的角度出發，甲基咪唑類陽離子為典型兩親性表面活性物質，其中甲基咪唑為親水集團，而相應鏈狀烷基為憎水集團。隨著烷基碳鏈長度的增加，溶解度會出現降低現象，傳質阻力隨之增加。Shiflett等[28]對陰離子為TFES 的系列甲基咪唑離子液體溶解度的測試表明[DMIN]溶解度低于[HMIN]，也驗證了該結論。其主要原因在于離子液體陽離子中烷基碳鏈過長時，離子液體溶液的表面吸附現象更加明顯，進而影響離子液體在水中的均一性和分散性。因此使用[DMIM]Ac 離子液體溶液時提取收率較[OMIM]Ac出現降低現象。這里使用[OMIM]Ac的提取收率明顯優于其他離子液體，故后續研究選擇該離子液體。

2.2 不同溶劑及加熱方式的提取收率比較

為考察不同工藝條件對黃連中小檗堿提取率的影響，在固液比1∶70、溶液pH=4、加熱時間8 min、提取溫度60℃和微波功率300 W 的相同工作條件下，分別研究水溶液常規加熱、水溶液微波加熱、乙醇溶液(0.5 mol/L)常規加熱、乙醇溶液(0.5 mol/L)微波加熱和[OMIM]Ac 離子液體水溶液(0.5 mol/L)微波加熱幾種不同提取工藝條件對提取收率的影響。結果如表1 所示。由表中數據可見，不同溶液體系對提取收率影響較大。乙醇溶液整體較水溶液提取收率更低。而水中加入離子液體后，提取收率可進一步提高。其原因在于乙醇分子相比水分子而言極性較小。溶液極性一般可用溶劑分子的偶極矩衡量[29]。為此，本研究在M06-2X/6-31G**方法水平上分別對水分子和乙醇分子進行了第一性原理方法計算，獲得水和乙醇單分子偶極矩分別為2.09 D 和1.58 D(1D=3.33564×10－30C·m)。該結果與實驗測定數值（分別為1.86 D 和1.68 D）能夠很好地對應。由此可見水分子的確較乙醇分子具有更大的偶極矩和分子極性，易于受外場作用而產生電子密度的極化作用。[OMIM]Ac 為咪唑類陽離子和醋酸陰離子構成的有機鹽，比常規有機分子具有更大的極性。這與本文計算獲得的[OMIM]Ac 離子液體偶極矩達到11.98 D 相符合。因此離子液體的極性顯著大于水。一般而言，極性較強的體系在微波場中具有更明顯的微波響應行為[14,30-31]。故離子液體的引入可實現從黃連中提取小檗堿收率的進一步提升。由此可見，離子液體和微波作為重要的輔助方法對于提取收率的提升都具有重要作用。

表1 不同工藝條件下黃連中小檗堿提取收率Table 1 Extraction yield of berberine hydrochloride under different conditions

2.3 提取工藝條件優化

2.3.1 固液比的影響 為考察固液比的影響，在離子液體濃度0.5 mol/L、溶液pH=4、微波時間8 min、提取溫度60℃和微波功率300 W 的固定條件下，開展黃連粉末質量與[OMIM]Ac 離子液體水溶液在固液比分別為1∶10，1∶30，1∶50，1∶70，1∶90 時小檗堿提取實驗。獲得的提取收率結果如圖3所示。隨著固液比的增加，萃取率呈現先升后降的趨勢。當固液比從1∶10 變化至1∶70 時，鹽酸小檗堿提取收率由46.2 mg/g 增加至58.9 mg/g。其原因可能在于同等質量黃連加大離子液體用量，增加了小檗堿與溶劑的相互作用概率，使其更容易被萃取出來。當固液比為1∶90 時，提取收率略微降低（54.4 mg/g）。這可能是由于大量微波能量被過量溶劑吸收，黃連樣品對微波能量的吸收相對減小，導致細胞壁破裂和傳質受到負面影響[32]。因此，持續增加離子液體溶液無法進一步提高小檗堿的提取收率。且考慮到離子液體價格相對昂貴，用量增多成本升高。故選擇黃連-離子液體溶液([OMIM]Ac,0.5 mol/L)的最佳固液比為1∶70。

圖3 不同固液比的提取收率Fig.3 Extraction yield by different solid-liquid ratio

2.3.2 溶液pH 的影響 為考察溶液酸堿性的影響，在離子液體濃度0.5 mol/L、固液比1∶70、微波時間8 min、提取溫度60℃和微波功率300 W 的相同工作條件下，將[OMIM]Ac 離子液體溶液pH 分別調節為1～7，進行黃連中小檗堿提取實驗。獲得的提取收率結果如圖4 所示。當pH 在1～3 時，萃取率呈現增加趨勢，但變化較平緩，萃取率僅由46.5 mg/g增加至47.5 mg/g。當溶液pH 增加至4時，提取收率顯著提升，達到58.9 mg/g。當pH 在5～7 時，萃取率呈現下降趨勢，但提取收率（48.6～50.4 mg/g）仍高于pH 在1～3 之間的結果。這可能是由于pH 會影響黃連中有效提取物在離子液體水溶液中的分配，進而影響提取率所致[33-34]。此外，咪唑類離子液體在不同pH 條件下會結合質子從而表現出不同的分子結構和極化性質，進而改變微波響應行為以及與小檗堿的相互作用。可見，離子液體溶液的pH 對提取效果仍具有一定影響。因此，取pH 為4最合適工藝條件。

圖4 不同溶液pH的提取收率Fig.4 Extraction yield by different pH of solution

2.3.3 微波加熱時間的影響 為考察微波加熱時間對提取收率的影響，在固液比1∶70、溶液pH=4、提取溫度60℃和微波功率300 W 的相同工作條件下，將濃度為0.5 mol/L的[OMIM]Ac離子液體溶液在微波加熱時間分別為2、4、6、8和10 min下進行黃連中小檗堿提取實驗。獲得的提取收率結果如圖5所示。根據溫度為單因素的實驗結果，發現微波加熱時間對于鹽酸小檗堿的提取收率具有一定影響。隨著微波加熱時間從2 min 延長至8 min，鹽酸小檗堿的提取收率從55.0 mg/g 增加至58.9 mg/g，呈現穩步增加趨勢。其可能原因在于微波加熱盡管速度較快，但仍是一個逐級升溫的過程。隨著微波加熱時間的延長，離子液體-水溶液體系與黃連樣品接觸時間和提取時間延長，這使得黃連中的小檗堿溶出更加充分。而當微波加熱10 min 時，鹽酸小檗堿提取收率為58.1 mg/g，略低于加熱8 min 時相應收率。其可能原因在于黃連樣品在微波場中吸收大量的能量，從而在細胞內部受過強熱應力作用[14]，這使得部分有效成分在該過程中發生轉化分解。故選擇最佳微波加熱時間為8 min。

圖5 不同微波加熱時間的提取收率Fig.5 Extraction yield by different microwave heating time

2.3.4 微波加熱溫度的影響 為考察溫度對提取的影響，在離子液體濃度0.5 mol/L、固液比1∶70、溶液pH=4、微波時間8 min 和微波功率300 W 的相同工作條件下，將[OMIM]Ac離子液體溶液微波加熱溫度分別設定為30、40、50、60和70℃進行黃連中小檗堿提取實驗。獲得的提取收率結果如圖6所示。當溫度從30℃升高到60℃時，鹽酸小檗堿提取收率呈現持續增加趨勢，由51.2 mg/g 逐步增加至58.9 mg/g。當提取溫度升高至70℃時，提取收率為57.5 mg/g，呈現小幅下降。溫度在現代統計熱力學上具有分子平均動能的統計學含義，可用于描述物體微觀尺度上分子熱運動的劇烈程度。在較高溫度下，離子液體水溶液中的分子熱運動比溫度低時更加劇烈，因此提取的傳質過程加速，可加快黃連中的細胞壁的破裂，強化離子液體與提取物的相互作用，使得小檗堿能夠更有效地被萃取出來。需要指出的是，溫度過高時需要增加額外動力消耗，使得成本增加。此外，過高溫度下強熱應力作用也可能導致小檗堿有效成分發生轉化或氧化分解。因此，60℃為最合適的溫度工藝條件。

圖6 不同微波溫度的提取收率Fig.6 Extraction yield by different microwave temperature

2.3.5 微波功率的影響 為考察提取微波功率對提取的影響，在固液比1∶70、溶液pH=4、微波時間8 min 和提取溫度60℃的相同工作條件下，將濃度為0.5 mol/L 的[OMIM]Ac 離子液體溶液分別設定微波功率200～800 W 進行黃連中小檗堿提取實驗。獲得的提取收率結果如圖7 所示。研究發現，當微波功率在200～700 W時，鹽酸小檗堿提取收率變化幅度很小，為58.1～58.9 mg/g。其中，微波功率為300 W 時，提取收率58.9 mg/g 為最高。當微波功率為800 W時，鹽酸小檗堿提取收率為56.7 mg/g，較200～700 W 時略有降低。其可能原因在于，微波功率在200～700 W 時，微波加熱的升溫較為平緩，能較穩定地達到所設定的溫度。當微波功率為800 W時，微波儀器功率較高，溫度控制不平穩，強熱效應可能破壞小檗堿分子結構，降低提取收率。另外，隨著微波功率增長，黃連植物細胞中更多種類的色素和膠質等也隨之溶出，影響后續分離。結合綠色化學理念，選擇微波功率300 W 為最合適工藝條件。

圖7 不同微波功率的提取收率Fig.7 Extraction yield by different microwave power

2.4 離子液體與小檗堿相互作用模擬及分析

使用基于第一性原理密度泛函理論的自洽場分子軌道法在M06-2X/6-31G**基組水平上分別對小檗堿和本研究選用的五種離子液體單獨體系以及相應復合體系首先進行幾何構型全優化，獲得各體系的平衡幾何構型。為了直觀刻畫小檗堿與離子液體分子結構之間的相互作用，對優化完畢的復合體系進行Kohn-Shame 波函數計算，并基于約化密度梯度(RDG)方法對復合體系的分子間相互作用進行可視化分析[25,35]。RDG 分析采用約化密度梯度函數[表達式為1/(2×(3×π2)1/3)×|?ρ(r)|/ρ(r)4/3，其中?是梯度算符，|?ρ(r)|即電子密度梯度的模]描述體系內部不同類型的相互作用。在RDG 等值面圖中，藍色區域ρ(r)>0、sign(λ2)<0，說明此區域表現為強吸引作用；綠色區域的ρ(r)=0，說明在此區域表現為范德華作用；紅色區域ρ(r)>0、sign(λ2)>0，表現為強互斥作用。

小檗堿與[BMIM]Ac和[OMIM]Ac兩種代表性離子液體的RDG 等值面和填色分析結果如圖8 所示。由圖可見，小檗堿的苯環和喹啉環中存在明顯的紅色棱形區域。這體現了六元環中較強的位阻效應，與散點圖中對應（+0.01, +0.05）之間的紅色部分相吻合。綠色和墨綠色片狀明顯分布在離子液體與小檗堿中間區域，以及離子液體陰陽離子之間。綠色和墨綠色區域的存在對應散點圖中（-0.02,0.01）部分。這證實了離子液體的羧基、咪唑環以及醋酸根離子與小檗堿之間的弱相互作用主要表現為范德華力。此外，小檗堿分子的兩個氧甲基之間也存在少量藍色片狀分布，對應散點圖中的（-0.05, -0.02）之間的藍色部分，該部分是小檗堿分子內部O…H 之間一種分子內氫鍵相互作用的體現。因此，RDG 等值面和散點分析形象直觀地說明離子液體與小檗堿之間的作用力主要是弱相互作用，表現為范德華力。

表2 小檗堿與離子液體分子間相互作用的結合能Table 2 Binding energy of the berberine interacted with ionic liquids

圖8 小檗堿與離子液體相互作用的約化密度梯度分析Fig.8 RDG analysis of berberine interacted with ionic liquids

為了進一步定量描述小檗堿與離子液體分子結構之間的相互作用，使用DFT 方法M06-2X 在6-31G**基組水平上對施加外場和外場去除情況下對本研究選擇的五種離子液體-小檗堿復合體系的相互作用結合能進行計算和統計，結果如表2 所示。由表可知，離子液體與小檗堿的分子間相互作用結合能均為負值，即離子液體與小檗堿的相互作用為放熱過程，二者的結合在能量上是有利的。無外場條件下，離子液體與小檗堿結合能在-90～-147 kJ/mol。施加外場作用后，離子液體與小檗堿復合體系的結合能數值明顯增大，處于-689～-806 kJ/mol。由此可見，施加外場的確可增大離子液體與小檗堿間結合能，即離子液體與小檗堿分子之間結合更加緊密。此外，對比結合能數值可知，外場消除時離子液體與小檗堿分子結合能可快速大幅減小，便于二者的分離。此外，由表中數據還可以發現，在施加外場條件下五種離子液體中[OMIM]Ac 與小檗堿復合體系的結合能數值最大，即復合體系相互作用最強，易于獲得較高提取率。這與前文提及的[OMIM]Ac 離子液體可獲得最高提取收率能夠很好地吻合。由此可見，離子液體與小檗堿分子之間結合能的數據可以很好地從分子尺度上解釋微波外場強化可提高離子液體溶液提取小檗堿收率。

3 結 論

本研究采用離子液體-微波聯合輔助方法，從黃連中提取小檗堿，實現提取的高效過程強化。主要結論如下。

(1)所選用的五種咪唑類離子液體中，[OMIM]Ac提取效果明顯優于其他離子液體。使用微波外場加熱方式獲得的小檗堿提取收率明顯優于常規加熱方式。且離子液體的加入可以實現小檗堿提取收率的進一步提升。離子液體和微波作為重要的輔助方法可以實現提取的強化傳質，達到小檗堿提取收率提升的效果。

(2)通過離子液體-微波輔助提取黃連中小檗堿實驗，對于0.5 mol/L的[OMIM]Ac離子液體溶液獲得最佳工藝條件為：黃連-離子液體溶液固液比1∶70；溶液pH=4,微波時間8 min,提取溫度60℃,微波功率300 W,在此條件下，鹽酸小檗堿的提取收率最高可達到58.9 mg/g。

(3)通過第一性原理的分子模擬對離子液體與小檗堿分子間相互作用進行了直觀刻畫和定量研究。RDG 分析結果表明離子液體與小檗堿之間的作用力主要是弱相互作用，表現為范德華力。離子液體與小檗堿分子間相互作用的結合能數據可以很好地從分子尺度上解釋微波外場強化可提高離子液體溶液對小檗堿的提取收率。