生物合成槲皮素糖苷類衍生物的研究進展

封悅洋，王穎，姚明東，肖文海，丁明珠

（1 天津大學前沿技術研究院，天津301700； 2 天津大學合成生物學前沿科學中心，天津300072；3天津大學系統生物工程教育部重點實驗室，天津300072）

引 言

糖苷是自然界中最普遍和最重要的物質之一，它在細胞通訊和生命協調中起到核心作用。糖苷類衍生物是在糖基轉移酶的作用下將糖基連接到苷元上而形成的一類產物。在植物中，糖苷分布廣泛，種類繁多。這些糖苷類衍生物往往表現出良好的溶解、生物活性或穩定性[1]。例如紅霉素[2]的糖基化可以提高水溶性，盞燈花素[3]和熊果苷[4]具有抗癌、抗氧化作用，而槲皮素[5]的糖基化可以通過保護其敏感化學基團和不穩定結構來提高其穩定性，并對α-葡萄糖苷酶或P450 酶表現出活性抑制作用[6-7]。

植物提取是獲得糖苷最普遍的方法，而有些植物生長周期長[8]，且產量嚴重依賴于地理位置、季節環境等多種因素。天然糖苷的有機合成仍然存在挑戰，特定糖苷鍵的立體選擇性形成常常受到許多反應基團的影響[9]，這需要各種保護和去保護步驟，由此產生的有毒廢物使其無法進行大規模生產。因此，在高市場需求和可持續性的推動下，生物發酵成為有發展潛力的解決方案。隨著微生物細胞工廠的廣泛應用，目前已經在大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物中合成多種植物糖苷，如紅景天苷[10]、東莨菪素[11]、人參皂苷[12]、香蘭素-4-O-葡糖苷[13]、天竺葵-3-O-葡萄糖苷[14]等。但糖苷在微生物中的產量并不高。主要問題在于糖基轉移酶與底物的適配性、前體UDP-糖供給不足或者宿主合成的植物苷元含量低不足以進行糖基化反應、有些植物苷元對微生物宿主產生毒性等，這些問題阻礙了生物合成糖苷產量的提升[15-17]。

槲皮素是自然界中最廣泛的一種黃酮類化合物，有100多種植物含有槲皮素，目前已經在植物中鑒定出300 多種不同的槲皮素糖苷類衍生物[15]。早在2004 年就已經實現槲皮素-3-單葡萄糖苷、槲皮素-3,7-雙葡萄糖苷的生物合成[18-19]。由于槲皮素糖苷衍生物具有抗癌、抗氧化等多種生物學效應[20]，成為國內外諸多領域的研究熱點。近些年來隨著合成生物學和代謝工程的快速發展，利用工程菌株生物合成槲皮素糖苷取得了巨大的進展。本文將以槲皮素糖苷的生物合成為例，對槲皮素糖苷類衍生物的前體槲皮素和糖基單元以及糖基轉移酶的催化反應過程進行系統的闡述，對提高工程菌株生物合成糖苷類化合物進行綜述和展望，為以后的深入研究和工業化生產提供參考。

1 槲皮素糖苷類衍生物

槲皮素分子含有5 個羥基，又稱為3,5,7,3',4'-五羥基黃酮。槲皮素中的C-3、C-7 和C-4'位羥基易于發生糖基化反應。研究表明，二磷酸尿苷糖（UDP-sugars）是植物糖苷的糖基提供者，槲皮素和二磷酸尿苷糖在糖基轉移酶（UGT）的催化作用下可形成糖苷，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-4'-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷。此外，槲皮素分子上可以連接多個糖基單元，從而形成槲皮素二糖或多糖（圖1），如槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3,7-O-雙葡萄糖苷[21]。

1.1 槲皮素的生物合成

槲皮素是一種生物活性黃酮醇，主要存在于洋蔥、蘋果、漿果和西蘭花等經常食用的植物性食物中。它具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫調節等作用，且對人體無毒[20]。槲皮素的生物合成，依賴于內質網膜和質膜上多種酶的協同作用[22]。其中，第一步是苯丙烷合成途徑，該途徑通過三個酶將苯丙氨酸（Phe）轉化為4-香豆酰輔酶A。隨后，通過苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）和4-香豆酰輔酶A 連接酶（4CL）的依次催化作用[23]，形成4-香豆酰基輔酶A分子。然后，在查爾酮合酶（CHS）作用下將一分子4-香豆酰基輔酶A與三分子丙二酰基-CoA 縮合，生成柚皮素查爾酮，這是9000 多種黃酮類衍生物的基本骨架[24]。接著，查耳酮異構酶（CHI）催化雜環C 的閉合，生成柚皮素，柚皮素是所有黃酮醇的通用前體。柚皮素借助黃酮3-羥化酶（F3H）合成二氫山柰酚，二氫山柰酚作為黃酮3'-羥化酶(F3'H)的底物生成二氫槲皮素，最后通過黃酮醇合成酶1（FLS1）的作用合成槲皮素[25]（圖2）。

圖1 槲皮素及其糖苷衍生物Fig.1 Quercetin and its glycoside derivatives

圖2 植物中槲皮素生物合成路徑Fig.2 Biosynthetic pathway for quercetin biosynthesis in plant

目前在多種微生物中實現了槲皮素的生物合成。利用工程酵母體外添加苯丙氨酸作為初始前體，在酵母中添加植物外源基因，即來自楊樹（Poplar）的PAL，來 自 大 豆(Glycine max)的C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H 和來自馬鈴薯(Solanum tuberosum)的FLS，實現槲皮素的生物合成，產量為0.38 mg/L[26]。在生產對香豆酸的大腸桿菌中添加6種植物來源的生物合成酶（即F3'5'H-CPR，4CL,CHS, CHI, FHT, FLS）實現了槲皮素的生物合成[27]。在鏈霉菌中，使用來自莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus）的酪氨酸氨裂合酶（TAL）進行異源生物合成，將L-Tyr直接轉化為對香豆酸，同時引入荷蘭芹（Petroselinum crispum）來源的柚皮素3-雙加氧酶（N3DOX）合成二氫山柰酚，最后通過來自擬南芥（Arabidopsis thaliana）的F3'H 和FLS1 首次在鏈霉菌中實現了槲皮素的全合成，產量為0.599 mg/L[28]。在谷氨酸棒狀桿菌中，以咖啡酸作為前體，分別表達來自荷蘭芹（Petroselinum crispum）的4CL，矮牽牛（Petunia x hybrida）的CHS、CHI 和F3H 以及來自非洲黑楊（Populus deltoides）的FLS 實現槲皮素的生物合成，滴度達到10 mg/L[29]。

由于槲皮素生物合成路徑所必需的基因數量多，異源生物合成系統的效率低，因此微生物合成槲皮素產量較低。此外，異源合成途徑中諸多的細胞色素P450 羥化酶都需要合適的P450 氧化還原酶（CPR）[30]作為還原配體，這也成為槲皮素異源合成的限速步驟之一。近年來，針對這一問題，在工程酵母中將擬南芥來源的C4H 和細胞色素P450 還原酶(ATR2) 配合使用，并過表達來自長春花（Catharanthus roseus）的CPR 和 矮 牽 牛（Petunia hybrida）的細胞色素P450 黃酮類單加氧酶(FMO)的融合蛋白CPR-FMO，可以提高類黃酮的生產代謝能力，使得槲皮素的產量達到20.38 mg/L[31]，這是目前微生物合成槲皮素的最高產量。微生物生物合成槲皮素產量的大幅提升為下一步槲皮素糖苷的生物合成奠定了基礎。

1.2 UDP-sugars的供給

UDP-sugars 作為糖苷合成的糖基供體主要包括UDP-葡萄糖(UDPG)、UDP-鼠李糖(UDP-Rha)、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-阿拉伯糖（UDPAra）、UDP-木糖（UDP-Xyl）、UDP-葡萄糖醛酸酯（UDP-GlcA）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDPGlcNAc)。這些UDP-sugars 的生物合成相互關聯，其中UDPG 是最重要的前體（圖3）。在微生物中葡萄糖經過葡萄糖激酶磷酸化后形成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)，經磷酸變位酶催化生成葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)，其作為底物與等摩爾的尿苷三磷酸(UTP)在葡萄糖-1-尿苷轉移酶的催化下形成UDPG[32-33]。UDPG 被UDP-葡萄糖-4-表異構酶催化形成UDP-半乳糖[34]，而經過UDPG 脫氫酶氧化形成UDP-葡萄糖醛酸酯[35-36]。UDP-葡萄糖醛酸酯經過脫羧反應形成UDP-木糖[34-35]，UDP-木糖經過UDP-木糖差向異構化合成UDP-阿拉伯糖[37]。UDP-N-乙酰氨基葡萄糖以G-6-P 為前體，通過己糖胺生物合成(HBS)途徑合成[38]。UDP-鼠李糖廣泛存在于植物中，以UDPG 為底物經鼠李糖合成酶（RHM）催化合成[39]。UDP-sugars作為生物代謝中的核心底物還被用于細胞壁的合成，氨基糖、核酸糖的代謝，以及微生物中次級代謝產物的合成。因此微生物內UDPsugars 供給不足是目前生物合成槲皮糖苷的關鍵問題之一。

1.3 糖基轉移酶

糖基轉移酶（GTs）可以將糖基供體上的糖基單元轉移到苷元上，形成多種糖苷類化合物。GTs 作為一個龐大的酶家族，根據其氨基酸序列相似性、形成糖苷的立體化學結構和已知底物的特異性，被分為98個家族。其中1號GTs家族含有的糖基轉移酶數量最多，且大部分成員在糖基化反應中以UDP-sugars 作為糖基轉移體，因此又被稱為尿苷二磷酸糖基轉移酶（UGTs）。植物中繁雜的糖基轉移酶可以特異性結合底物，從而產生不同的次級代謝產物。所有植物糖基轉移酶中存在一個保守序列，即植物次生代謝特征序列（PSPG box），它是作為鑒定未知酶是否為糖基轉移酶的參考依據[40-42]。

圖3 UDP-sugars生物合成途徑Fig.3 UDP-sugars biosynthesis pathway

Willits 等[43]最早在大腸桿菌中實現槲皮糖苷的合成。他們將擬南芥中的AtUGT73B2 克隆至大腸桿菌中，酶純化后，以槲皮素為底物進行孵育，HPLC檢測得到槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3,7-O-雙葡糖苷。在體內實驗中，大腸桿菌過表達AtUGT73B2，體外飼喂槲皮素進行發酵，HPLC 檢測同樣得到與體外實驗相同的產物。隨后Lim 等[44]分析了擬南芥中91 種糖基轉移酶的體外活性，發現AtUGT88A1 可以體外合成四種槲皮素單糖苷，分別是槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3'-O-葡萄糖苷、槲皮素-4'-O-葡萄糖苷；AtUGT76E12 和AtUGT71C1 分別合成槲皮素-3,7-O-雙葡糖苷和槲皮素-7,3'-O-雙葡糖苷。利用大腸桿菌過表達擬南芥糖基轉移酶并外加槲皮素作為底物，HPLC 檢測可以發現AtUGT76E12 和AtUGT71C1 合成3-O-，7-O-，3'-O-，3,7-di-O-，7,3'-di-O-葡糖苷，AtUGT74F1 合成4'-O-葡萄糖苷。因為AtUGT73B3 在大腸桿菌體內實驗中特異性合成單一產物槲皮素-3-O-葡萄糖苷且產量最高（8.96 mg/L），Lim 等[44]將表達AtUGT73B3 的大腸桿菌在發酵罐中進行培養，得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷產量為99.3 mg/L，產率為10%。近幾年通過對糖基轉移酶的研究以及宿主內UDP-sugars 代謝路徑的改造合成了多種槲皮素糖苷衍生物，表1 綜述了各種槲皮素糖苷的生物合成。

2 槲皮素糖苷類衍生物的微生物合成

宿主內UDP-sugars 的供給以及糖基轉移酶的選擇對糖苷的生產至關重要。為提高工程菌株中糖基前體的供給，常用的策略包括過表達天然UDP-sugar 合成路徑中的基因、敲除消耗UDPsugars 的非必需途徑，以減弱天然代謝網絡對UDPsugars 的調控。對不同來源糖基轉移酶的篩選以及酶改造可以提高糖基轉移酶對UDP-sugars 的親和力從而提高糖苷的合成。

表1 槲皮素糖苷在大腸桿菌中的生物合成Table 1 Biosynthesis of quercetin glycosides in E.coli

2.1 糖基轉移酶功能性改造

雖然有些UGT 具有廣泛的底物特異性，但大部分糖基轉移酶表現出糖供體和底物特異性[56-57]。例如來自植物的F7GAT 是一種類黃酮7-O-葡萄糖醛酸轉移酶，其Arg350 與UDP-GlcA 葡糖醛酸部分的陰離子羧酸鹽接近，Ser127 可能也與它的羧酸氧形成氫鍵。這兩個氨基酸對于識別UDP- GlcA 至關重要[58]。紅雛菊(Bellis perennis)中的BpUGT94B1 也是UDP-葡萄糖醛酸轉移酶，其分子模擬表明，Arg25的長帶正電荷側鏈在葡萄糖醛酸C6位置的負電荷羧基附近延伸，與之相互作用，識別這種糖[59]。UDPG 中的葡萄糖部分主要與PSPG Box 中的最后兩個殘基谷氨酸和色氨酸相互作用，使2-，3-，4-OH 形成多個氫鍵。這些殘基和區域是糖識別和結合的決定因素[15]。

由于還沒有UGTs 被報道使用UDP-木糖作為糖供體，Han 等[60]利用模擬的UGT 進行分子對接實驗，尋找對UDP-木糖親和力高的糖基轉移酶。AtUGT78D3（以UDP-Ara 為底物）由于其三維結構已被確定，所以被用于對接研究。AtUGT78D3 的His 380 會與UDP-木糖的磷酸相結合，這種結合導致槲皮素的3-羥基(糖附著位點)與UDP-木糖之間的距離為4.45 ?(1 ?=0.1 nm) [圖4(a)]。這表明，UDP-木糖和槲皮素與AtUGT78D3 的結合可能是無效的。用Gln380 取代His380 后，槲皮素的3-羥基與UDP-木糖的距離為3.67 ?，因此AtUGT78D3(H380Q)使得UDP-木糖與槲皮素的結合更加緊密[圖4(a)]。對接結果通過定點突變進行了驗證，UGT78D3(H380Q)對UDP-木糖表現出明顯的親和力。通過過表達基因ugd，增強UDPG 到UDP-GlcA的轉化，敲除UDP-葡萄糖醛酸C-4-脫羧酶(編碼基因arnA)減少UDP-GlcA 的消耗[61]，最終得到槲皮素-3-O- 糖 150 mg/L[50]。 來 自 苜 蓿（Medicago truncatula）的糖基轉移酶UGT71G1 通過酶工程[62]改造表明，UGT71G1 突變體F148V 和Y202A 顯著改變了槲皮素糖基化的區域選擇性[圖4(b)]，從識別B 環的3'-O-位轉為識別C 環的3-O-位，主要產生槲皮素3-O-葡萄糖[63-64]。

圖4 糖基轉移酶功能性改造范例Fig.4 Paradigms for functional modification of glycosyltransferases

結構域交換也是一種酶工程策略，可生成用于糖基化反應的糖基轉移酶嵌合體。糖基轉移酶的UGT74F1 和UGT74F2 通過交換結構域產生了嵌合體，該嵌合體改變了槲皮素上原有糖基化位點的偏好和特異性，產生了對槲皮素的4-OH 糖基化的新偏好，并且UGT74F1單個突變N142Y 也增加了對槲皮素4'-OH的催化選擇性[65][圖4(c)]。

2.2 UDP-sugars內源合成途徑的優化

在大腸桿菌中合成槲皮素糖苷衍生物是目前的研究熱點[66-67]。通過對大腸桿菌天然UDP-sugars代謝途徑進行調控從而提高糖基前體的供給[68]。大腸桿菌中UDPG 的天然代謝路徑是從外界攝取葡萄糖開始，經過葡萄糖激酶、磷酸變位酶和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷轉移酶得到UDPG。

Pandey 等[69]將來自皮諾卡氏菌(Nocardia farcinica)的葡萄糖磷酸變位酶（編碼基因nfa44530）引入大腸桿菌，該酶催化從G-6-P 到G-1-P 的生化反應。將基因naf44530與galU融合過表達，提高了合成UDP-sugars重要前體UDPG的供給。而G-6-P是合成UDPG 的前體，在大腸桿菌中G-6-P 會被6-磷酸葡萄糖1-脫氫酶和磷酸葡糖異構酶分別轉化為6-磷酸葡萄糖內酯(6-phosphogluconolactone)和果糖-6-磷酸（F-6-P）。利用堿基突變破壞染色體上的zwf和pgi基因，減少G-6-P 的消耗。同樣的方法破壞UDPG 水解酶減少UDPG 的降解，同時過表達來自棘孢小單孢菌(Micromonospora echinosporasp.Calichenesis)的UDP-葡萄糖脫氫酶增加了UDPG 向UDP- GlcA 的碳通量。由于大腸桿菌中沒有從UDP-GlcA 到UDP-Xyl 的天然代謝途徑，通過引入棘孢小單孢菌的UDP-葡萄糖醛酸脫氫酶實現了大腸桿菌中UDP-Xyl 的生物合成(圖5)。通過糖基轉移酶AtGt3催化3-OH 的糖基化反應，最終實現了槲皮素-3-木糖的生物合成[49]。

相似的方法也用于槲皮素-3-葡糖苷酸的合成。Kim 等[51]通過過表達大腸桿菌內源基因ugd，敲除UDP-葡萄糖醛酸C-4 脫羧酶阻斷UDP-GlcA 向UDP-戊酮糖的轉化。經糖基轉移酶VvUGT 催化，槲皮素-3-葡糖苷酸產量為687 mg/L(圖5)。

2.3 UDP-sugars合成路徑的正交化設計

大部分UDP-sugars 的合成依賴于G-6-P 至G-1-P 的生物轉化，由于G-6-P 還會用于糖酵解和戊糖磷酸途徑（PPP），因此G-6-P 的合成被認為是主要瓶頸[70]。因此有必要新建一條UDP-sugars 合成路徑，該路徑與宿主內源UDP-sugars 合成路徑正交，分別用于糖苷合成和菌體生長。植物蔗糖合酶（sucrose synthase,SUS,EC 2.4.1.13）,以NDP-葡萄糖和果糖為底物催化合成蔗糖，同時，蔗糖合酶也可將蔗糖直接水解為果糖和UDPG，從而進行UDPsugars 的合成（圖6）。Pei 等[48]通過將大豆蔗糖合酶(GmSUS)與UDP-葡萄糖-4-表異構酶偶聯，合成UDP-半乳糖，通過對槲皮素具有高活性的矮牽牛糖基轉移酶（PhUGT）合成槲皮素-3-半乳糖苷。糖基轉移酶反應后會生成一分子UDP，UDP 在蔗糖合酶和UDP-葡萄糖-4-表異構酶催化下再生出UDPGal(圖6)。這種UDP-sugars 再生系統不僅降低了所需的UDP-sugars底物成本，而且還避免了UDP對產物的抑制[16,71-72]。這一策略使得槲皮素-3-半乳糖苷的轉化率達到92%，產物最終滴度為2134 mg/L[48]。

圖5 大腸桿菌中UDP-sugars內源合成路徑優化Fig.5 Optimization of UDP-sugars endogenous synthesis pathway in E.coli

圖6 大腸桿菌中UDP-sugars合成路徑的正交化設計Fig.6 Orthogonal design of UDP-sugars synthesis pathway in E.coli

另一種蔗糖代謝路徑來自于雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)。將雙歧桿菌蔗糖磷酸化酶(BaSP)引入大腸桿菌，蔗糖被分解為果糖和G-1-P，果糖用于生長目的，G-1-P 在尿苷轉移酶（來自于雙歧桿菌）催化下用于合成UDPG 的前體。為了防止G-1-P 轉化為生物質前體，敲除了參與G-1-P 代謝的幾種內源基因[73]，如pgm和葡萄糖-1-磷酸酶編碼基因agp。通過敲除基因ushA和半乳糖操縱子有效地防止UDPG 的代謝（圖6）。同時過表達擬南芥來源的鼠李糖合成酶（MUM4）保證了UDPRha 的供給[74]。引入擬南芥糖基轉移酶(AtGt)最終槲皮素-3-鼠李糖苷的產量為1120 mg/L[47]。

3 展 望

以槲皮素為例，綜述了微生物生產糖苷類化合物的合成策略。著重敘述了槲皮素的生物合成途徑，所需的糖基轉移酶，通過結構改造調整糖基轉移酶的特異性，以及調控內源路徑和引入正交化的UDP-sugars 合成路徑來提升前體UDP-sugars 的供給等工程策略，實現菌體生長和糖苷合成之間的平衡。這些策略使微生物高產糖苷類化合物成為可能，但在實際生產中仍存在一系列挑戰，如過表達酶的不溶性、工業放大中苷元轉運以及廉價混合碳原的生物利用效率等。未來通過使用分子伴侶和助溶蛋白標簽將會改善酶的可溶性表達，通過引入轉運蛋白或調控細胞膜結構有望提高苷元的轉運效率。

盡管大規模糖苷類生物合成還處于起步階段，但隨著代謝工程和合成生物學的發展，微生物在特定代謝產物的合成方面已經取得了許多進展。尤其是人工合成酵母的問世[75-76]，可以讓人們更理性更高效地實現基因的大片段重組和優良底盤菌株的構建。隨著人類對微生物體系越來越深入的認識，以及糖基化策略的不斷改良，將會開啟生物合成糖苷類化合物的新時代。