丹參素對銀屑病樣細胞Yes相關蛋白表達及細胞增殖、凋亡的影響

賈金靖 莫秀梅 劉俊峰 王寧 鄭焱 陳達燦

1西安交通大學第二附屬醫院皮膚科710004；2廣州中醫藥大學第二附屬醫院皮膚科510120

Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo 信號通路的關鍵組分，其在調控細胞增殖和凋亡等方面發揮重要作用［1-2］。我們的前期研究［3］發現，銀屑病皮損YAP 陽性率升高，YAP 主要表達于皮損組織基底層和棘層下部，基底層作為表皮的生發區，提示YAP 在銀屑病表皮異常增殖中發揮重要作用。治療銀屑病的方劑中丹參多見［4-5］。體外實驗研究表明，丹參素在多種腫瘤細胞中均有抑制細胞增殖、引起細胞周期阻滯、誘導凋亡以及抑制侵襲和轉移等作用［6-10］。用含白細胞介素1α（IL-1α）、IL-17、IL-22、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、抑癌蛋白M（oncostatin M）的混合物M5刺激人永生化表皮細胞（HaCaT）后其病理生理學特征與銀屑病高度類似，既往有很多文獻將其作為銀屑病樣細胞模型［11-13］。本研究檢測丹參素對M5誘導的銀屑病樣細胞模型中YAP 的表達情況，探討其對角質形成細胞增殖、細胞周期以及凋亡的影響。

資料與方法

一、實驗材料與儀器

HaCaT 細胞（上海復祥生物科技有限公司）、DMEM 培養液（美國HyClone 公司）、丹參素（C9H10O5，相對分子質量162.14，純度95%，大連美侖生物技術有限公司）、M5（IL-1a、IL-17、IL-22、TNF-α、Oncostatin M，美國PeproTech 公司）。兔抗人YAP 抗體（美國Cell Signaling 公司）。細胞周期相關蛋白抗體：兔抗人細胞周期蛋白A（Cyclin A）、兔抗人Cyclin B1、鼠抗人Cyclin D1、鼠抗人Cyclin E（美國Santa Cruz公司）。細胞凋亡相關蛋白抗體：兔抗人胱天蛋白酶3剪切體（cleaved-caspase-3）、兔抗人p21（沈陽萬類科技有限公司），兔抗人Bcl-2、兔抗人BAX（美國Cell Signaling公司）。鼠抗人p53（美國Santa Cruz 公司）。鼠抗人β 肌動蛋白抗體、HRP 標記的羊抗兔二抗、HRP 標記的羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）。細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。流式細胞儀（FACSCalibur，美國BD公司）。

二、銀屑病樣細胞模型構建

HaCaT細胞由含10%胎牛血清及100 U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養液在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。采用M5（含10 μg/L 的IL-1α、IL-17、IL-22、TNF-α、Oncostatin M）作用于細胞48 h，制作銀屑病樣細胞模型［11-13］。HaCaT 細胞加入M5的同時分別加入0（丹參素對照組，以下簡稱對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素刺激細胞，以未做處理的HaCaT細胞為空白對照組。

三、實時定量PCR檢測丹參素對銀屑病樣細胞模型YAP mRNA表達的影響

丹參素刺激細胞48 h 后，采用Trizol 試劑盒提取各實驗組細胞總RNA，反轉錄得到cDNA 后擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，YAP引物序列：正向5′-GCTAGACCCAAGGCTT GACC-3′，反向5′-ATTTGCTGTGCTGGGATTGA-3′；GAPDH 引物序列：正向5′-CACTGTGCCCATCTAC GAGG-3′，反向5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′。PCR 擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40 個循環，獲取各組標本的標準曲線，計算機分析Ct值，采用2-ΔΔCt法計算YAP mRNA的相對表達。

四、Western 印跡檢測丹參素對銀屑病樣細胞模型YAP及相關蛋白水平的影響

丹參素刺激細胞48 h后，提取各組細胞總蛋白并進行蛋白定量，取25 μg 蛋白行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，加入特異性一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，曝光、顯影、定影，掃描后用Image J 軟件分析目標條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

五、細胞增殖實驗

采用噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞的增殖能力。取對數生長期細胞接種于96 孔板，每孔5 ×103個細胞加200 μl培養液，培養24、48、72 h后，每孔加入MTT 20 μl，避光孵育4 h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，采用酶標儀490 nm 波長測定各孔吸光度（A 值）間接反映活細胞數量。每組設5個復孔。

六、細胞周期檢測

按照細胞周期試劑盒說明書操作，常規消化各組細胞，PBS 洗滌2 次，于-20 ℃、75%乙醇溶液中固定過夜，再次用PBS 洗滌2 次，加入終濃度為100 μg/ml的RNaseA和50 μg/ml的PI染色液，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測各組細胞周期，激發波長488 nm，采用Modifit 軟件分析檢測結果。Western印跡檢測丹參素刺激48 h后各組細胞細胞周期相關蛋白的相對表達。

七、細胞凋亡檢測

按照細胞凋亡試劑盒說明書操作，常規消化各組細胞，PBS 洗滌2 次，2 000 轉/min（離心半徑9.7 cm）離心5 min，收集1×105～5×105個細胞，加入500 μl 的結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC 混勻后再加入5μl PI 染色液混勻，室溫避光孵育5 ～15 min，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。Western印跡檢測丹參素刺激48 h后各組細胞凋亡相關蛋白的相對表達。

八、統計學方法

結 果

一、YAP在銀屑病樣細胞模型中的表達

實時定量PCR 與Western 印跡結果顯示，銀屑病樣細胞模型組YAP mRNA、蛋白相對表達（2.03 ± 0.04、2.20 ± 0.02）均高于HaCaT 細胞組（0.95 ± 0.03、1.01 ± 0.02，t = 21.93、44.38，均P ＜0.001）。見圖1。

二、丹參素對銀屑病樣細胞模型YAP 表達的影響

實時定量PCR 與Western 印跡結果顯示，空白對照組與0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組YAP mRNA、蛋白的相對表達水平差異有統計學意義（F = 93.96、56.65，P ＜0.001），對照組YAP mRNA、蛋白的相對表達水平均高于空白對照組（P ＜0.001），亦高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），YAP mRNA 及蛋白表達水平隨丹參素濃度的增加呈降低趨勢。見圖2。

三、丹參素對銀屑病樣細胞模型增殖能力的影響

空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組細胞分別在培養24、48、72 h 時的增殖活力差異均有統計學意義（F=43.17、71.65、88.39，均P ＜0.001），在培養24 h時，對照組細胞增殖活力高于0.5 mmol/L 丹參素組細胞（P ＜0.001）；培養48、72 h 時，對照組細胞增殖活力均高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），且隨著丹參素濃度的增加增殖能力呈降低趨勢。見圖3。

圖1 Western 印跡檢測YAP 在銀屑病樣細胞模型中的表達銀屑病樣細胞組YAP蛋白的表達高于HaCaT細胞組

圖2 實時定量PCR（2A）與Western 印跡（2B）檢測丹參素對銀屑病樣細胞模型YAP 表達的影響 丹參素可抑制銀屑病樣細胞模型中YAP mRNA、蛋白的相對表達。1：空白對照組；2 ～5：分別為0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組。a：與對照組相比，P ＜0.01

圖3 MTT 法檢測丹參素處理銀屑病樣細胞模型24、48、72 h對細胞增殖的影響 丹參素可抑制銀屑病樣細胞模型的增殖。a：與對照組相比，P ＜0.01

四、丹參素對銀屑病樣細胞模型細胞周期的影響

空白對照組、0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組G0/G1 期、S 期、G2/M 期細胞比例差異均有統計學意義（F = 61.55、313.60、9.20，均P ＜0.01）。0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組進一步兩兩比較，除對照組與0.125 mmol/L 丹參素組、0.25 與0.5 mmol/L 丹參素組間G0/G1 期細胞比 例，0.125 與0.25 mmol/L 丹參素 組、0.25 與0.5 mmol/L 丹參素組間G2/M 期細胞比例差異無統計學意義（均P ＞0.05），余各組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組G2/M 期細胞比例高于對照組，S 期細胞比例低于對照組；0.25、0.5 mmol/L 丹參素組G0/G1期細胞比例高于對照組。見圖4。

Western印跡結果顯示，空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E 蛋白相對表達水平差異均有統計學意義（F = 206.50、92.89、280.36、48.45，P ＜0.001）。對照組、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P ＜0.05），對照組相對表達水平均高于0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組。見圖5。

五、丹參素對銀屑病樣細胞模型凋亡的影響

空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組的凋亡率差異有統計學意義（F=154.08，P ＜0.001），對照組、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組間兩兩比較，除對照組與0.125 mmol/L 丹參素組差異無統計學意義（P ＞0.05），余各組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。對照組凋亡率低于0.25、0.5 mmol/L丹參素組。見圖4。

Western印跡結果顯示，空白對照組、對照組與0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹 參 素 組 細 胞cleavedcaspase-3、Bcl-2、BAX、p53、p21 的相對表達水平差異均有統計學意義（F=15.42、19.36、33.98、17.11、26.81，P ＜0.001），0.5 mmol/L 丹參素組cleavedcaspase-3 水平高于對照組、0.125 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），對照組、0.125 與0.25 mmol/L 丹參素組間兩兩比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹參素組Bcl-2 水平低于對照組、0.125 mmol/L丹參素組（均P ＜0.05），對照組、0.125與0.25 mmol/L 丹參素組間兩兩比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹參素組BAX 水平高于0.25 mmol/L 丹參素組，0.25 mmol/L 丹參素組高于0.125 mmol/L 丹參素組及對照組（均P ＜0.05），對照組與0.125 mmol/L丹參素組間差異無統計學意義（P ＞0.05）；0.5 mmol/L丹參素組p53水平高于對照組、0.125 mmol/L 丹參素組（均P ＜0.05），0.125 與0.25 mmol/L 丹參素組、0.25 與0.5 mmol/L丹參素組甲差異無統計學意義（均P ＞0.05）；0.5 mmol/L 丹參素組p21 水平高于0.25 mmol/L 丹參素組，0.125 mmol/L 丹參素組高于對照組（均P ＜0.05），0.125與0.25 mmol/L丹參素組間差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖5。

圖4 流式細胞儀檢測丹參素對銀屑病樣細胞模型細胞周期及凋亡的影響 4A、4C：丹參素處理組S期細胞比例降低，G0/G1期、G2/M期細胞比例升高；4B、4D：丹參素可促進細胞凋亡。1：空白對照組；2 ～5：分別為0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組。a：與對照組相比，P ＜0.05

圖5 Western印跡檢測丹參素刺激48 h后各組細胞周期相關蛋白、凋亡相關蛋白的表達 對照組Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E蛋白相對表達水平高于0.125、0.25、0.5 mmol/L 丹參素組；對照組cleaved-caspase-3 相對水平低于0.5 mmol/L 丹參素組，BAX 水平低于0.25、0.5 mmol/L丹參素組，p53、p21水平低于0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組，Bcl-2水平均高于0.5 mmol/L丹參素組。1：空白對照組；2 ～5：分別為0（對照組）、0.125、0.25、0.5 mmol/L丹參素組。a：與對照組相比，P ＜0.05

討 論

近來研究發現，YAP在多種惡性腫瘤中表達上調，參與腫瘤的發生、發展［14］。D′Addario 等［15］發現，在正常人原代角質形成細胞中過表達YAP 后，可使原代角質形成細胞永生化增殖，阻礙其正常分化進程。以往研究發現，YAP 可通過下游RASAKT/ERK 通路促進皮膚鱗狀細胞癌的進展［16］，我們既往的研究證實，YAP在銀屑病皮損組織中表達增加［3］，提示YAP可能作為銀屑病發病機制中的關鍵分子，如能通過外界手段干預其表達，將有望發揮治療銀屑病的作用。丹參是治療銀屑病的常用中藥之一，體外實驗發現，在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、黑素瘤等多種腫瘤細胞中，丹參素均有抑制細胞增殖、引起細胞周期阻滯、誘導凋亡以及抑制侵襲和轉移等作用，上述作用可能與其較強的自由基清除和抗氧化活性、抑制AKT 以及ERK1/2 的磷酸化水平有關［6-10］，這些機制及通路與我們前期研究中YAP 在皮膚鱗狀細胞癌中發揮作用的相關信號通路一致［16］。

本研究結果表明，丹參素可以抑制銀屑病樣細胞模型中YAP mRNA 及蛋白的表達，同時也可以抑制細胞增殖、引起細胞周期阻滯在G0/G1 期，并且不同程度地抑制細胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1 及Cyclin E 的表達，而這些蛋白的表達可通過影響細胞周期的轉換進而影響細胞的增殖［17］。因此，我們推測，丹參素可能正是通過影響這些細胞周期蛋白的表達發揮抑制銀屑病細胞增殖的作用，引起細胞周期阻滯在G0/G1期。細胞凋亡相關蛋白中，Caspase-3 是多種凋亡途徑的下游效應部分，被認為是調控凋亡的執行蛋白酶，其激活（即被剪切為cleaved-caspase-3）代表細胞凋亡機制進入了不可逆轉的階段［18］；Bcl-2 和BAX 同屬于Bcl-2 家族，二者在調亡調控過程中功能是相互對抗的，Bcl-2 表達高于BAX 時，抑制細胞凋亡，反之則促進細胞凋亡［19］。P53 基因是人體內的抑癌基因，有促凋亡的作用，而p21 是其下游調控細胞凋亡的關鍵靶基因［20］。本研究發現，丹參素可誘導銀屑病樣細胞的凋亡，并同時增加促凋亡蛋白cleaved-caspase-3、BAX、p53、p21的表達，抑制Bcl-2的表達，提示丹參素可能是通過影響這些凋亡相關蛋白的表達促進銀屑病樣細胞的凋亡。既往研究證實［3］，在HaCaT細胞中敲除YAP后可抑制細胞的增殖，促進凋亡，將細胞周期阻滯在G0/G1期，本文中丹參素對銀屑病樣細胞的作用與上述HaCaT 細胞中敲除YAP 后細胞的表現高度吻合，且引起細胞周期相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達改變趨勢也基本一致。同時，本研究也發現，丹參素可呈劑量依賴性地降低YAP 的表達水平，因此推測丹參素通過影響YAP 的表達，進而抑制了銀屑病表皮角質形成細胞的異常增殖而發揮治療作用。

綜上，本研究結果提示，丹參素可能通過抑制銀屑病樣細胞中YAP 的表達，進而發揮細胞周期阻滯、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。本研究尚處在初步探索階段，具體的信號通路機制等仍有待后續研究進一步完善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突