不同產地苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜和主成分分析

徐瀅 劉明穎 廖小菁 李瑤芳 王章偉 胡長玲 劉地發 鄧雙炳

苦木,為苦木科苦樹屬植物Picrasma quassioides(D.Don)Benn.,藥用部位為干燥莖、枝和葉,性寒,味苦,有清熱解毒、祛濕的功效,主要用于風熱感冒、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、蛇蟲咬傷等癥[1]。苦木中的主要化學成分為生物堿類成分,苦味素類成分次之[2]。《中華人民共和國藥典》2015年版一部、江西省中藥材標準2014年版[3]、湖南省中藥材標準2009年版[4]和廣東省中藥材標準第三冊2018年版[5]中苦木質量標準均未收載指紋圖譜項,苦木質量研究報道多為單個或若干個生物堿的含量測定研究[6-7],作為可較為全面地表征中藥物質基礎的關于苦木枝的指紋圖譜的研究尚無報道。

根據國家藥品監督管理局數據庫顯示,有147個藥品批文,其中包括苦木注射液、復方苦木消炎片、消炎利膽片等10個品種,129家企業使用到苦木藥材表明苦木的市場需求量很大。苦木屬于野生藥材資源,生長周期長,且苦木莖、枝和葉的細胞組成差異較大,導致成分種類和成分含有量差異均較大[8],如何合理有效地利用苦木藥材具有重要意義。我國中藥制劑的質量參差不齊,不同廠家的同中藥制劑、同廠家同中藥制劑,甚至同廠家同品種的不同批次之間的中藥制劑質量差異都較大,除了因生產工藝差異較大和生產工藝參數不穩定外,影響最大的就是藥材的質量,因為不同產地、不同采收期、不同藥用部位的藥材化學成分的種類和成分含有量差異較大[9]。針對中藥制劑質量差異大的現狀,有學者提出通過控制藥材質量、不同批次藥材調配和不同批次提取物勾兌投料等方法[10],以實現不同批次中成藥制劑間質量的穩定均一。控制藥材質量是實現不同批次藥材調配和提取物勾兌投料的前提,本文以10個產地10批苦木枝為研究對象,建立其指紋圖譜,通過兩種不同的相似度評價方法,采用主成分分析對其質量進行評價,可為苦木的合理利用和質量控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；電子分析天平XS105DU、ML204T(梅特勒-托利多科技有限公司)；超聲清洗器KQ-300DE(昆山市超聲儀器有限公司)；數顯恒溫水浴鍋HHS-11-2(上海博迅實業有限公司)。

1.2 軟件

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版,國家藥典委員會)；程度相似度評價軟件[11](1.0版,清華大學中藥現代化中心羅國安教授研究團隊自主開發)；SPSS Statistics 21.0軟件(IBM)。

1.3 材料

乙腈(HPLC,TEDIA公司),冰醋酸、無水乙醇(均為分析純,廣東光華科技股份有限公司),鹽酸(分析純,西隴化工股份有限公司),水為超純水 (Mili-Q 自 制)。 1-甲 酸-6-羥 基-β-咔 巴 啉(6-hydroxy-β-carboline-1-carboxylic,20160607)、4,5-二甲氧基鐵屎米酮(4,5-dimethoxycanthin-6-one,20170912WS)、 1-甲 酸-β-咔 巴 啉 ( β-carboline-1-carboxylic acid,20171019WS)、3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮(3-methylcanthin-5,6-dione,20160630)、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮(5-hydroxy-4-methoxylcanthin-6-one,20170901WS)均為自制,經光譜學鑒定結構,質量平衡法檢測其含量分別為94.0%、99.7%、98.1%、96.0%、98.8%[12]。10個產地苦木枝樣品共10批,由復旦大學胡長玲博士采自各產地(見表1),經中國科學院昆明植物研究所龔洵研究員鑒定為苦木科苦樹屬植物苦木Picrasma quassioides的枝,于江西青峰藥業有限公司留存。

表1 10批苦木枝樣品產地

1.4 色譜條件

Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相0.2%冰醋酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～9分鐘,15%→18%B；9～12分鐘,18%→21%B；12～15分鐘,21%→30%B；15～20分鐘,30%→36%B；20～25分鐘,36%→50%B；25～40分鐘,50%→90%B；40～45分鐘,90%→15%B)；后運行10分鐘；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm,進樣量20 μL。

1.5 對照品溶液的制備

精密稱取 1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、4,5-二甲氧基鐵屎米酮、1-甲酸-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮和 4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮約10 mg,于100 mL量瓶中,加2%鹽酸溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到對照品溶液貯備液；再精密移取上述溶液1 mL,于25 mL量瓶中,加2%鹽酸稀釋至刻度,搖勻,即得。

1.6 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號篩)約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%乙醇50 mL,超聲處理30分鐘,放置至室溫,搖勻,濾過。將上述濾液置蒸發皿中,水浴蒸干,用2%的鹽酸10 mL分三次溶解提取物,并轉移至50 mL量瓶中,超聲10分鐘使之溶解,加2%鹽酸稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

1.7 方法學考察

1.7.1 儀器精密度試驗 取同一苦木枝(S1),按“1.6”項下方法制備供試品溶液,按“1.4”項下色譜條件連續進樣6次,以18號峰為參照峰,測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于2.0%,表明儀器精密度良好。

1.7.2 重復性試驗 取同一苦木枝(S1)6份,按“1.6”項下方法平行制備供試品溶液,按“1.4”項下色譜條件分別進樣,以18號峰為參照峰,測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3.0%,表明本方法重復性良好。

1.7.3 穩定性試驗 取同一苦木枝(S1),按“1.6”項下方法制備供試品溶液,按“1.4”項下色譜條件分別在0小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時、24小時進樣,以18號峰為參照峰,測得共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3.0%,表明供試品溶液在24小時內穩定性良好。

2 結果

2.1 苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜測定

分別取10批不同產地的苦木枝,按“1.6”項下方法平行制備供試品溶液,按“1.4”項下色譜條件分別進樣,記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)對所得譜圖進行處理,共標記24個共有峰,且共有峰占比大于90%。經與對照品溶液保留時間和紫外吸收特征圖譜比對,確認樣品圖譜中3號峰為1-甲酸-6-羥基-B-咔巴啉、6號峰為1-甲酸-B-咔巴啉、8號峰為3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮、18號峰為4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、23號峰為4,5-二甲氧基鐵屎米酮。4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮為苦木枝主要活性成分,且其峰面積較大,與相鄰色譜峰分離度較好,因此選擇4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮(18號峰)為參照峰。以S1號色譜圖為參照譜圖,采用中位數法,時間窗為0.1,多點校正后自動匹配生成對照圖譜,見圖1～2。

圖1 對照指紋圖譜

圖2 10批苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜和對照指紋圖譜

2.2 相似度評價

將10批苦木枝色譜圖導入中藥色譜圖譜相似度評價系統(2012版),以“2.1”項中生成對照圖譜,進行相似度評價,10批樣品相似度均大于0.9,說明10個產地整體上一致性較好,但是從譜圖上來看20～26分鐘這個時間段上各產地在成分的種類和含量上有較大的差別。因此以“2.1”項中生成對照圖譜的共有峰面積為對照,將其和10批樣品共有峰面積按照保留時間順序導入程度相似度評價系統(1.0版)中,得到各批次的程度相似度。

結果顯示,10批樣品相似度大于0.9,程度相似度大于0.7,表明10個產地的苦木枝化學成分一致性較好。廣東英德、廣西河池、廣西梧州、貴州都勻和江西贛州的兩種相似度值較其余5個產地的高,表明該5批相似度較高,對對照圖譜貢獻率較高。結果見表2。

2.3 主成分分析

主成分分析是較為常用的多指標、多變量降維的分析方法,可用于中藥材綜合質量的評價。為了更好地評價樣品,將10批苦木枝共有峰峰面積通過SPSS Statistics 21.0軟件標準化描述后,通過降維中的因子分析,計算相關系數矩陣、主成分特征值、累計貢獻率和主成分綜合得分等,結果見表3、表4、圖3和圖4。

表2 10批苦木枝相似度結果

表3 特征值和方差貢獻率

以特征值大于1為提取標準,得到前2個主成分的累計貢獻率為92.358%,代表苦木枝中24個成分量92.358%的信息量,具有很好的代表性,可代表苦木枝的質量。從表4可以得出,第1主成分信息主要來源于色譜峰 2、3、6、8、9、12、16 ～18、20、24,其中色譜峰3、8、18影響較大,分別為1-甲酸-6-羥基-B-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮和 4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮,均為苦木的活性成分,其中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮為其主要活性成分；第2類主成分信息來源于色譜峰 1、7、10、11、23；第 3 類主成分信息來源于色譜峰13。根據各主成分載荷向量除以各主成分特征值的算術平方根計算得到各批次的綜合得分。主成分分析結果顯示,廣東英德、廣西河池、廣西梧州、貴州都勻和江西贛州的5批苦木枝成分含有量較其余5批的高,其中S2綜合得分最好,質量最好。綜合得分結果,程度相似度、相似度結果一致,表明主成分分析可以更加直觀的評價苦木枝的質量,與兩種相似度的結果形成互補。結果見表5。

表4 初始因子載荷矩陣

圖3 公共因子碎石圖

圖4 樣品在3個主成分的平面分布圖

表5 主成分得分和綜合得分

3 討論

中藥制劑和中藥材為多組分復雜體系,中藥材質量的穩定可靠是中藥制劑質量穩定可靠的前提保障,中藥指紋圖譜[13]是建立在中藥化學成分系統研究的基礎上,對中藥化學成分物質基礎的一種整體表達方式,能較好地體現中藥材的復雜性和整體性,是一種有效的中藥材質量分析手段。目前筆者未見對苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜的報道,本文首先通過對提取方式、提取溶劑、提取時間、溶劑倍數、檢測波長、流動相、色譜柱等進行考察,綜合得到獲得苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜的最佳提取方法和最佳色譜條件。

隨著化學計量學在藥學方面的不斷應用,不少學者通過對中藥指紋圖譜進行主成分分析研究[14-15],可以更好地分析指紋圖譜的數據,從而更加直觀地表征中藥的特征。本文通過相似度評價、程度相似度評價和主成分分析3種方式,對不同產地的苦木枝的24個共有峰進行分析,結果表明10個產地的苦木枝化學成分均一性較好,但是作為主產地的廣東和廣西的成分含有量較高,綜合得分也較高,其中S2得分最高、質量最好。表明地理位置和生長環境對藥材化學成分有一定的影響,地理位置較為接近的,化學成分較為一致,相似度較高,一定程度上證明道地藥材的重要性。本文通過指紋圖譜和主成分分析對不同產地苦木枝進行質量評價,可以更加直觀地評價苦木枝的質量,可為苦木枝的質量控制及其制劑的投料提供參考依據。