清熱活血中藥聯用對急性腦缺血再灌注大鼠mTOR-ERRα-GLS信號通路的調節作用

張鶴 劉雪梅 曾子修 劉曉漢 張昕洋 田楊 徐榛敏 張允嶺

能量代謝紊亂被認為是腦梗死急性期主要病理機制之一,腦缺血是線粒體損傷的重要因素,線粒體作為細胞代謝的重要場所,其損傷主要體現在ATP合成減少、氧化損傷及鈣離子穩態失調等,這些損傷共同作用誘導線粒體通透性改變,從而誘發神經元的凋亡[1-2]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是細胞能量感應分子,具有感知細胞能量狀態的功能,可調節細胞的新陳代謝、周期進程及細胞生長[3]。研究表明[4-5],mTOR通過雌激素相關受體 α(estrogenrelated receptor α,ERRα) 可 調控谷氨酰 胺酶(glutaminase,GlS),從而影響線粒體谷氨酰胺的回補代謝,為三羧酸循環(tricarboxylic acid,TCA)和脂質合成等能量代謝提供一定的物質基礎。

苦碟子注射液具有活血止痛、清熱祛瘀的功效。臨床研究發現[6],苦碟子注射液對腦梗死急性期血瘀證兼熱證或熱證均具有良好的臨床效果；注射用血栓通具有活血祛瘀、通脈活絡的功效。二藥目前都已是上市的臨床一線用藥,單獨使用治療腦梗死均有一定的療效,二藥聯合治療腦梗死是否可起到協同增效的目的及其作用機制仍不明確。因此,在本次研究中,借助大鼠大腦中動脈阻塞腦梗死(middle cerebral artery occlusion rats,MCAO)模型,從mTOR-ERRα-GLS信號通路的角度探討清熱活血中藥聯用(苦碟子注射液+注射用血栓通)的協同增效作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠95只,體重(200±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養于北京中醫藥大學東方醫院動物實驗中心,室溫22～25℃,濕度40%～60%,12小時晝夜交替。本次實驗經過東方醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑

苦碟子注射液(通化華夏藥業有限責任公司,Z20025450)；注射用血栓通(凍干)(廣西梧州制藥(集團)股份有限公司,15030509)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(Sigma,T8877)；蛋白提取液(天德悅生物科技有限公司,WB0028)；BCA蛋白濃度測定套裝(天德悅生物科技有限公司,WB0028)；SDS-PAGE預制膠套裝(北京百奧思科生物醫學技術有限公司,MD911919)；蛋白上樣buffer(Amresco,0332)；封閉液(Proteintech B400040)；電泳液(北京百奧思科生物醫學技術有限公司,MD6620)；轉膜液(北京百奧思科生物醫學技術有限公司,MD6621)；中等蛋白分子量 marker(Thermo,26617)；酶標二抗羊抗鼠(北京百奧思科生物醫學技術有限公司,MD2142)；酶標二抗羊抗兔(天德悅生物科技有限公司S004)；Anti-Glutaminase antibody(Abcam,Ab93434)；mTOR Antibody(Thermo Fisher,2972)；Anti-Estrogen Related Receptor alpha antibody(Abcam,Ab76288)。

1.3 主要儀器與耗材

MCAO栓線(北京西濃科技有限公司,A4-243250)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司,DHG-9145A)；制冰機(SCOTSMAN,AF10)；低溫離心機(Sigma,3-30K)；去離子水儀(PALL,Purelab Plus)；PVDF 膜(Millipore,ISEQ00010)；脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司,TS-100)；旋渦混勻器(海門麒麟醫用儀器廠,XW-80A型)；電泳儀(北京百晶生物技術有限公司,BG-subMIDI)；SDS-PAGE電泳系統(Bio-rad Mini-PROTEAN?)；凝膠成像系統(UVP,GelDoc-It310)；化學發光成像系統(Bio-rad 170-8280)。

1.4 急性腦缺血再灌注大鼠模型

參照Longa等[7]建立改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞腦梗死模型,缺血1.5小時,再灌注72小時。采用10%水合氯醛按照400 mg/kg進行腹腔麻醉。麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術臺,頸部正中切口,逐層分離,暴露左側頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸內動脈(internal carotid artery,ICA)和頸外動脈(external carotid artery,ECA)。結扎CCA近心端及ECA,動脈夾夾閉左側CCA,于CCA剪開一斜口,將頂端光滑的魚線通過斜口插入,打開動脈夾,靜CCA分叉處進入ICA直至大腦大腦中動脈(middle carotid artery,MCA),結扎CCA遠心端固定魚線,逐層縫合皮膚,魚線殘留端1 cm左右暴露于體外。缺血1.5小時后拔出魚線,再灌注72小時。

1.5 動物分組與給藥

術后待大鼠清醒后根據Longa等[7]評分隨機分為模型組、清熱組、活血組和清熱活血組。假手術組,操作同模型組,暴露血管,但不進行插線操作。本次實驗共分為5組,每組19只。

根據大鼠體表面積公式dB(mg/kg)=dA×(RB/RA)×(WA/WB)1/3,其中dB是大鼠的公斤體重劑量,dA是人的公斤體重劑量,WA、WB是已知人和大鼠的體重,RA、RB是體型系數(RA=0.1,RB=0.09)。經計算給予清熱組大鼠苦碟子注射液3.6 mL/kg,活血組給予注射用血栓通40 mg/kg。根據團隊前期研究結果[8],清熱活血組劑量為苦碟子注射液1.8 mL/kg,1小時后予注射用血栓通80 mg/kg,假手術組大鼠不予處理,模型組予3.6 mL/kg生理鹽水。給藥采用腹腔注射的方式,術后3小時給藥一次,以后每天給藥1次,共給藥4次。

1.6 大鼠神經功能缺損評分

神經行為學觀察：根據Garcia JH等[9]評分從6個方面來評定大鼠神經功能損傷情況,即大鼠自主運動、體態對稱性、前肢伸展功能、網屏實驗、身體雙側觸覺和雙側胡須反射,神經功能無缺損得分最高為18分,神經功能損傷最嚴重者得分最低為0分。

1.7 TTC染色法評價腦梗死體積

處死動物,快速取腦,置于-20℃,冰凍15分鐘,將腦組織由前向后冠狀切片,切為5片,厚度約為2 mm,浸泡于1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetraznlium chloride,TTC)染液中,37℃避光孵育15～20分鐘,用4%多聚甲醛溶液固定腦切片,每組8只。腦梗死體積按如下公式計算：梗死半球體積百分比(%)=(各腦切片梗死面積×切片厚度之和)/(各腦切片面積×切片厚度之和)×100%。

1.8 干濕重法檢測腦含水量

提取各組大鼠左側大腦半球并稱重,將腦組織置于110℃干燥箱中烘烤24小時,將腦組織取出后立即稱量缺血腦半球的干重,按照Billiot公式計算腦含水量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.9 Western blot法檢測 mTOR、ERRα、GLS蛋白表達

提取各組大鼠左側大腦皮層組織總蛋白,加適量蛋白酶抑制劑的裂解液,冰上勻漿,在4℃ 條件下離心13000 r/min,20分鐘,取上清液,置于-80℃保存；BCA法蛋白定量,濃度測定后,加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,混勻,濕法轉膜,放入5% 脫脂奶粉中封閉,室溫下搖床震蕩1小時。5%脫脂奶粉配制一抗,mTOR兔多克隆抗體(1∶200),ERRα小鼠單克隆抗體(1∶100),GLS兔多克隆抗體(1∶100),β-action(1 ∶500)。PBST漂洗5分鐘×3次,加入辣根酶標記羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶3000),室溫下搖床震蕩1小時。PBST漂洗5分鐘×3次。滴加 ECL發光液1分鐘,置于成像系統曝光顯影條帶。實驗重復3次,運用Image J軟件對蛋白條帶進行光密度值分析,以β-actin為內參。

1.10 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析,實驗數據以均數±標準差(±s)來表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 各組急性腦缺血再灌注大鼠神經功能評分

造模后,大鼠出現左側(同側)Horner征陽性,眼瞼下垂,眼裂變小,眼球內陷及瞳孔縮小。右側(對側)肢體活動功能障礙,肌力減退,提尾懸空時呈強迫體態,軀體向右側扭轉,雙上肢交叉。與假手術相比,模型組大鼠神經功能評分顯著性降低(P＜0.01)。與模型相比,三個中藥組大鼠的神經功能缺損均有改善(P＜0.05),但中藥各組之間差異無統計學意義(P＞0.05),詳見表1。

表1 各組急性腦缺血再灌注大鼠神經功能評分比較(±s)

表1 各組急性腦缺血再灌注大鼠神經功能評分比較(±s)

注：與假手術組相比,aP＜0.01；與模型組相比,bP＜0.05。

組別 鼠數 神經功能評分(分)19 17.83±0.40模型組 19 10.20±1.03a清熱組 19 11.75±2.49b活血組 19 11.87±1.45b清熱活血組 19 13.11±1.45假手術組b

2.2 TTC染色測定各組急性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積

對大鼠腦組織切片進行TTC染色,紅色為正常組織,白色則為梗死灶。假手術組大鼠腦切片染色后呈現紅色,模型組大鼠左側大腦皮層海馬及紋狀體可見白色梗死灶,各組中藥治療后腦梗死體積都有一定的改善。與模型組相比,中藥各組腦梗死體積均顯著性降低(P＜0.01)。在三個中藥組之間,清熱活血組大鼠腦梗死體積較清熱組和活血組大鼠腦梗死體積都有所降低,差異有統計學意義(P＜0.05),清熱組和活血組兩組間無明顯差異(P＞0.05),詳見圖1、表2。

表2 各組急性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積比較(±s)

表2 各組急性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積比較(±s)

注：與模型組相比,aP＜0.01；與清熱組及活血組相比,bP＜0.05。

組別 鼠數 腦梗死體積(%)33.16±4.02清熱組 8 27.83±2.56a活血組 8 25.33±2.66a清熱活血組 8 20.01±2.88模型組8 ab

2.3 各組急性腦缺血再灌注大鼠術后腦含水量的測定

造模后,大鼠腦組織都有一定程度的水腫,大鼠腦含水量增加。模型組大鼠腦含水量顯著高于假手術組(P＜0.01)。與模型組相比,各中藥組大鼠腦含水量顯著降低,差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。各中藥組間比較無明顯差異(P＞0.05),詳見表3。

圖1 各組急性腦缺血再灌注大鼠腦組織TTC染色

表3 各組急性腦缺血再灌注大鼠術后腦含水量比較(±s)

表3 各組急性腦缺血再灌注大鼠術后腦含水量比較(±s)

注：與假手術組相比,aP＜0.01；與模型組相比,bP＜0.05,cP＜0.01。

組別 鼠數 腦含水量(%)77.10±0.49模型組 8 80.20±0.97a清熱組 8 79.10±0.61b活血組 8 78.20±1.20c清熱活血組 8 78.60±0.88假手術組8 c

2.4 各組急性腦缺血再灌注大鼠梗死側皮層mTOR-ERRα-GLS蛋白的表達

mTOR-ERRα-GLS信號通路蛋白表達情況如圖2、表4所示。與假手術組相比,模型組mTOR表達水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,清熱活血組mTOR表達增加(P＜0.05),清熱組和活血組mTOR有升高的趨勢,但差異無統計學意義(P＞0.05)。

與假手術組相比,模型組ERRα表達顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,清熱組、活血組及清熱活血組ERRα表達水平均顯著增加(P＜0.01)。與清熱組相比,清熱活血組 ERRα表達增加(P＜0.05),清熱組與活血組之間ERRα表達無明顯差異(P＞0.05)。

與假手術組相比,模型組GLS表達顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比,各中藥組GLS表達水平增加(P＜0.05或P＜0.01)。與清熱組相比,活血組、清熱活血組GLS表達增加(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠梗死側皮層mTOR-ERRα-GLS蛋白的表達情況

表4 各組急性腦缺血再灌注大鼠mTOR-ERRα-GLS信號通路蛋白表達情況(n=3)

3 討論

腦梗死屬于中醫中風病的范疇,其病因病機百家爭鳴、學說頗多。劉完素提出“火熱致中”的理論為后世醫家開啟了內傷中風的先河。目前公認中風病的病理因素主要包括風(肝風)、火(心火、肝火)、痰(風痰、濕痰)、血(血瘀)、氣(氣逆)、虛(陰虛、氣虛)六端,這些病理因素相互作用、相互影響,在腦梗死發生發展過程中常常為多種證素的組合,因此在治療上采用單一的治則不能滿足所有的證候,從而致療效受限。目前,腦梗死急性期多從“熱”、從“瘀”論治,本團隊前期臨床研究發現[10],腦梗死急性期患者多表現多為昏瞀、不語、目眵多糊、呼吸急促、口臭、脈疾、痰色黃等火熱表征；除此之外,亦有瘀血表象,如面色晦暗、肌膚甲錯等,苦碟子注射液具有清熱功效,注射用血栓通活血效力顯著,二者聯用,清熱與活血的藥效互補,因此,提出了聯用清熱及活血中藥注射液治療腦梗死急性期可提高臨床療效的設想。在本次研究中觀察MCAO術后大鼠出現同側Horner征陽性,對側肌力減退,走路時轉向病灶側,提尾時身體扭向健側,上述表現提示造模成功。缺血再灌注損傷后,大鼠神經功能缺損明顯,各個治療組大鼠的神經功能缺損及腦梗死體積較模型組都得到改善,而清熱組及清熱活血組改善效果更為明顯。在缺血再灌注過程中,大鼠腦組織出現了水腫,腦含水量增加,其中活血組及清熱活血組療效更為顯著。結合上述所有療效指標,可以看出苦碟子注射液、注射用血栓通聯合應用對缺血再灌注損傷療效更佳。

能量障礙通常出現在腦缺血再灌注損傷的急性缺血期,由于血管閉塞,缺血缺氧造成各種神經元細胞正常生理活動所需能量物質不能及時送達,線粒體損傷及ATP生成障礙,從而導致能量代謝紊亂[11]。研究發現[12-13],苦碟子注射液及注射用血栓通均具有改善能量代謝障礙的藥理作用,故本研究從mTOR-ERRα-GLS信號通路為切入點觀察清熱活血中藥聯用協同增效的作用機制。mTOR的活性受到缺氧、ATP耗竭和DNA損傷的抑制,亦可被營養和生長因子的激活[14]。目前mTOR通路在腦缺血損傷過程中發揮的作用仍存在爭議。研究表明[15-16],幾種神經保護劑如抗氧化劑褪黑素、雌二醇和水飛薊賓等可上調mTOR的表達。亦有研究報道[17],mTOR抑制劑在體外糖氧剝奪離體腦缺血模型中減輕了缺血對細胞損傷。在本次實驗中,模型組 mTOR的表達降低,清熱活血組上調了mTOR的表達。mTOR通過ERRα可調控GLS,從而調節谷氨酰胺的含量。谷氨酰胺是人體內含量最豐富的游離氨基酸。雖然谷氨酰胺不是必需氨基酸,但它可為細胞生長提供最重要的含氮、含碳營養物質,并為細胞生長提供能量[18]。谷氨酰胺提供能量的方式有兩種,一種是脫氨基生成谷氨酸,谷氨酸脫氨基生成α-酮戊二酸直接參與三羧酸循環循環,另外一種是補充三羧酸循環合成的原料,即檸檬酸,使三羧酸循環循環順暢的進行[19]。清熱組和活血組中ERRα、GLS較模型組表達增加,但只有清熱活血組mTOR、ERRα、GLS表達均增加。由此,可以推測清熱活血組分治療腦梗死急性期可起到協同增效的目的,其作用機制可能是通過調控mTOR-ERRα-GLS信號通路,與增加腦組織中能量代謝,改善腦組織能量代謝紊亂密切相關。