不同表面樣式引導骨再生生物膜對細菌黏附能力影響的研究

儲順禮，崔 巖，周延民，李嫻靜，李 威

(1.吉林大學口腔醫院 種植科，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院；3.吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科)

生物材料應用于人體，對醫學進步做出了顯著貢獻，然而，生物材料在植入人體初期也扮演著異物的角色，也會為細菌定植提供了合適的場所[1]。在口腔骨缺損再生治療中，引導骨再生(GBR)生物膜必不可少，臨床應用中由于組織張力過大經常會出現生物膜暴露感染，關于生物膜表面細菌黏附定植對比研究國內外甚少，本研究基于此，研究不同表面樣式引導骨再生生物膜對變形鏈球菌黏附的影響，以期獲得相關參數，從而指導生物膜的臨床應用以及研發。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

依據專利[2]，采用鹽析法制備出PPC[聚碳酸亞丙酯，poly(propylene carbonate),簡稱PPC] / PBS[聚琥珀酸丁二酯，poly(butylene succinate),簡稱PBS] 引導骨再生生物膜(簡稱PPC/PBS膜)，修剪成5 mm×5 mm大小，環氧乙烷熏蒸消毒后備用；海奧生物膜(20 mm×25 mm)購自于煙臺正海生物科技股份有限公司，修剪成5 mm×5 mm大小后環氧乙烷熏蒸消毒備用。變形鏈球菌336931購自于北納創聯生物技術有限公司；BHI血瓊脂平板。

1.2 實驗分組及表面形態檢測

采用鹽析法制備的PPC/PBS膜以及市售的海奧生物膜，依據其表面形態，可以分為粗糙面和光滑面，對四種樣式的表面進行分組，依次為PPC/PBS膜多孔面組、PPC/PBS膜光滑面組(依據專利制備的PPC/PBS基引導骨再生生物膜表面其中一面非常光滑，孔很少很小，記為PPC/PBS膜光滑面，另外一面非常粗糙，有很多相通的孔，記為PPC/PBS膜多孔面)、海奧膜非UP面組、海奧膜UP面組(海奧生物膜表面其中一面印有UP字樣，該UP面相對較為致密，另一面無UP字樣，相對較為粗糙，臨床操作中非UP面與骨缺損直接接觸，UP面與軟組織相接觸)。對上述四組表面形態結構進行掃描電鏡檢測。

1.3 細菌黏附實驗

將實驗用變形鏈球菌336931菌株接種于BHI瓊脂平板，進行復蘇培養，形態學檢查為純培養物，厭氧培養48 h，制成濃度為6×108的菌懸液。將上述四組生物膜分別置于24孔培養板，實驗面朝上，生物膜周邊應用橡皮泥填平(防止菌液從周邊滲透進入非實驗面)，應用口腔正畸用金屬結扎絲將其固定位于培養板的最底部保持穩定，環氧乙烷熏蒸消毒后，各加入0.2 ml細菌懸液，置入厭氧培養罐內，37℃恒溫培養24 h后取出生物膜，用PBS緩沖液清洗5次。然后每個樣本置入離心管內加入PBS緩沖液 2 ml，超聲洗滌60 s，收集原液并進行10倍倍比稀釋至10-3。取10 μl菌液接種于BHI瓊脂平板上厭氧培養48 h進行菌落生長數量計數。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 掃描電鏡觀察各樣本表面形貌結果顯示兩種生物膜具有不同孔大小的表面結構形態。海奧膜光滑面較為致密，膠原束排列較不規則稍顯松散，粗糙面較為疏松，可見膠原纖維呈束狀排列，相鄰膠原束排列較松散 。PPC/PBS膜光滑面表面非常光滑致密，很平整，微米級孔很少見。多孔面呈多孔狀，表面均為微米級孔所覆蓋，孔大小不一，大孔孔徑約200 μm，平均孔徑約120 μm。具體見下圖1所示。

2.2 靜態培養狀態下兩組試件表面變形鏈球菌黏附數的比較菌落計數結果顯示：PPC/PBS多孔面和海奧膜非UP面黏附數最多，兩者無統計學差異，其次是海奧膜UP面，數量次之，最少的是PPC/PBS膜光滑面，數量最少，PPC/PBS膜光滑面與其它組相比較差異有顯著性，海奧膜UP面與其它組相比差異有顯著性,具體數據見表1。

圖1 掃描電鏡下兩種生物膜表面形態(A：海奧膜UP面；B：海奧膜非UP面；C：PPC/PBS膜光滑面；D：PPC/PBS膜多孔面)

表1 變形鏈球菌24 h黏附量的菌落形成單位計數(1×105CFU/mm2,Mean±SEM)

3 討論

口腔微生態系統是由微生物、宿主與口腔環境之間相互作用、相互依賴而組成的統一整體。但當外源物進入口腔內可能會改變口腔微生態環境，破壞口腔微生態平衡從而引發炎癥等[3]。在臨床骨缺損中廣泛應用的GBR生物膜即屬于外源物，然而，在GBR操作中，由于植入物導致局部張力很大，再加上術后局部的水腫，往往會造成軟組織創口術后裂開，生物膜易暴露于口腔微環境中。這種生物膜一旦暴露于口腔微生態環境中，口腔微生物勢必會附著于表面，這在一定程度上影響了GBR的效果甚至會導致局部的感染引起失敗等。

微生物發揮致病性的首要步驟是在宿主或者外源物表面的黏附[3]。細菌的黏附被認為在感染的發病機制中起著重要作用。影響細菌黏附的因素較多，主要包括三個方面：修復體材料(如修復材料的表面結構粗糙度等)、微生物(如微生物的種類等)、宿主(如口腔衛生等)[4,5]。有研究表明材料表面細菌的黏附量與材料的粗糙程度有一定的相關性，表面結構越粗糙，細菌黏附量增多，粗糙的表面可為細菌提供附著的場所并產生屏蔽效應，對細菌在材料表面的早期黏附量有重要影響[6,7]。在本研究掃描電鏡結果顯示，PPC/PBS膜光滑面十分光滑，海奧膜UP面相對較為致密光滑，而PPC/PBS膜多孔面、海奧膜非UP面均較為粗糙。若依據上述表面結構粗糙與細菌黏附相關性推測：PPC/PBS膜光滑面和海奧膜UP面表面相對更為致密，細菌的黏附相對較少，而PPC膜多孔面、海奧膜非UP面表面十分粗糙相對更有利于細菌的黏附。

變形鏈球菌是口腔主要致病菌之一，屬于最早定植菌，對牙齒等口內物表有很高的親和力，為后續細菌定植等提供便利[8]。因此本研究選用變形鏈球菌進行對比研究。本實驗結果提示，在相同培養條件下，PPC/PBS膜光滑面和海奧膜UP面表面黏附的細菌量明顯低于PPC/PBS膜粗糙面、海奧膜粗糙面，且PPC/PBS膜光滑面也地獄海奧膜UP面，差異有顯著性。這也與掃描電鏡結果相一致，PPC/PBS膜光滑面呈現的表面形態非常光滑致密，不利于細菌的黏附定植；海奧膜UP面次之；而表面相對較為粗糙的PPC/PBS膜粗糙面、海奧膜粗糙面其表面形態更有利于細菌的黏附。這與Badih[9]的研究結果相類似，材料粗糙度越大，細菌越容易黏附。

GBR生物膜主要應用于引導骨再生中隔絕軟組織細胞進入到骨再生空間，都具有兩個表面，一面貼附于骨缺損直接與骨或骨替代材料接觸，另一面貼附于軟組織與軟組織創口直接接觸。上述變形鏈球菌在不同表面結構生物膜材料表面具有不同的黏附特性提示我們，為防止或盡量減少細菌在GBR生物膜表面黏附，建議臨床上在條件允許的情況下應盡量選用其中一面為更為光滑的GBR生物膜，且在臨床應用中不可以將生物膜多孔面和光滑面位置顛倒，以免細菌在生物膜表面聚集影響骨再生效果。