miRNA-223與IgE在小鼠鼻腔息肉組織中的差異性表達與意義

鄧啟華，牟忠林，汪奕龍，馮勇軍，王明婧，林麗英，李澤濛，盧大松

(海南醫學院第二附屬醫院 耳鼻咽喉頭頸外科,海南 海口570311)

鼻息肉(Nasal polyps)是來源于鼻粘膜和鼻旁竇的息肉樣組織[1]。經常伴有變應性鼻炎[2]。鼻息肉的臨床癥狀包括鼻充血、慢性鼻竇炎、嗅覺喪失和頭痛[1]。鼻息肉發病機制尚不清楚，最普遍認為是由鼻過敏引起的[2]。在變態反應發作期間，肥大細胞被激活釋放化學介質，例如組胺，以誘導粘膜水腫和局部炎癥，在鼻息肉的發展中起重要作用。鼻息肉的發病機制中，IgE起到了不可或缺的作用[3]，其不僅增加了變態反應的癥狀，引起機體Th1/2細胞分化的不均衡，還能合成各種細胞毒性物質，促進嗜酸性粒細胞的生成，引起肥大細胞脫顆粒。傳統免疫學認為鼻息肉的發生機制只是由單純的I型變態反應通路調控[4]，但在最新的微觀免疫學研究中，發現了新的影響因子microRNA。microRNA(miRNA)已顯示在調節細胞活性中起關鍵作用。miRNA是一類進化保守的、內源性的、非編碼的小RNA，其長度約為22個核苷酸。據估計，它們可調節60%以上的蛋白質編碼基因，這些基因與靶基因的3'UTR結合，從而抑制靶基因的翻譯和/或誘導靶基因mRNA的降解[5]。目前已經證明一部分miRNA在變態反應中起到關鍵作用[6]。目前國內外尚無文獻闡述變態反應性疾病中鼻息肉中IgE的表達與miRNA-223的表達之間的影響，本實驗擬建立采用革蘭陰性細菌產物脂多糖(LPS)建立的亞洲人特點鼻息肉小鼠模型，檢測鼻息肉小鼠鼻黏膜組織miRNA-223的表達。然后構建慢病毒敲低載體感染小鼠后區鼻腔黏膜組織，檢測慢病毒敲除鼻息肉小鼠鼻黏膜組織中的IgE與miR-223表達，闡明鼻息肉中IgE的表達與miR-223的表達之間的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 30例鼻息肉患者的鼻息肉樣本(男15例，女15例),年齡17-51歲，平均(32.1+9.2)歲。30例同期行單純鼻中隔矯正手術患者的鼻甲樣本(男15例，女15例)，年齡18-55歲，平均(34.1+8.1)歲。兩組患者在性別、年齡間無統計學差異意義(P>0.05)，具有可比性。在研究之前的三個月中，沒有患者接受糖皮質激素或其他抗體治療。所有患者均簽署了知情同意書，所有實驗均獲得本醫院倫理委員會的批準與監督。所有組織標本都保存在-80℃直至使用。

1.1.2動物 80只體重18-22 g雄性健康C57BL/6J小鼠購自北京生命科學研究所。小鼠置于溫度為22±2℃，濕度為60±5%，光照/黑暗周期為12 h的環境下飼養。小鼠可以自由獲取食物和飲用水。

1.1.3試劑 脂多糖(LPS)購自北京索萊寶科技有限公司。TRIzol試劑、cDNA逆轉錄試劑盒和TB GreenTM Premix Ex Taq II試劑盒購自TaKaRa公司。陰性對照、miR-223 inhibitor由Genepharma公司合成。抗小鼠免疫球蛋白E(IgE)多克隆抗體、抗小鼠中性粒細胞過氧化物酶(MPO)多克隆抗體、抗小鼠嗅覺標記蛋白(OMP)多克隆抗體和山羊抗鼠IgG二抗購自美國Abcam公司。ELISA試劑盒購于美國BOSTER公司。HE試劑盒和免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋。PVDF膜購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1臨床組織樣本 收集鼻息肉病患者和健康對照者的下鼻甲的黏膜。提取總RNA用于相應的基因表達。

1.2.2鼻息肉小鼠模型制作及分組給藥 小鼠適應性喂養1周后，分為4組，每組20只，分別為：(1)對照組(control組)、(2)模型組(LPS組)、(3)模型+陰性對照組(miR-NC組)、(4)模型+miR-223 inhibitor組(miR-223 inhibitor組)。造模組小鼠每側鼻孔每次滴入10 μl LPS(10 μg/μL)，一周3次，持續12周；對照組小鼠每側鼻孔每次滴入10 μl無菌生理鹽水，一周3次，持續12周。造模期間剔除死亡和沒有造模成功的小鼠。第13周，第3組小鼠通過尾靜脈注射轉染空載病毒的293T細胞懸液(5×106個/mL)200 μl；第4組小鼠通過尾靜脈注射轉染敲低miR-223慢病毒的293T細胞懸液(5×106個/mL)200 μl；第1組和第2組小鼠尾靜脈注射等體積的無菌生理鹽水。

1.2.3嗅覺障礙評估 食物小球隨機埋藏在墊料中，深度1 cm左右。實驗前1天晚上8點開始，各組小鼠禁糧，但水可以自由飲用。第2天上午將各組小鼠投入到實驗場中，300秒內(取3次測試平均值)未找到食物小球的小鼠定為嗅覺功能存在障礙。

1.2.4HE染色 實驗結束后立即將小鼠鼻腔外側壁先用4%多聚甲醛固定，然后放在4% EDTA中脫鈣處理，待其完全軟化后即可包埋、切片(5 μm)，用蘇木精和曙紅(HE)染色，通過顯微鏡觀察每個組織切片的圖像，并使用顯微鏡以200倍的放大倍數拍攝鼻粘膜組織組織的圖像。

1.2.5免疫組織化學 實驗結束后立即將小鼠鼻腔外側壁先用4%多聚甲醛固定，然后放在4% EDTA中脫鈣處理，待其完全軟化后即可包埋、切片(5 μm)、脫水、緩沖液清洗，3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清20 min，滴加一抗、PBS沖洗、滴加二抗、沖洗后加ABC復合物、DAB顯色，并使用顯微鏡以200倍的放大倍數拍攝圖像。

1.2.6ELISA檢測鼻腔中細胞因子的表達 小鼠通過腹腔注射10%水合氯醛深麻醉并進行部分氣管切開術。從氣管的開口沿鼻孔的方向將22號導管插入后鼻孔。將無菌生理鹽水(1 ml)輕輕注入鼻腔，灌洗液從前鼻孔收集，在220×g和4℃下離心10 min，并將上清液保存在-20℃下。鼻灌洗后在麻醉下通過脫臼處死小鼠。通過ELISA檢測上清液中的細胞因子表達水平。

1.2.7qPCR 實驗結束后，用剪刀將小鼠鼻部整個剪下來，然后從中間剪開，暴露整個鼻腔外側壁，這時可用小剪刀或剝離子將鼻腔外側壁粘膜剝除干凈。用TRIzol試劑提取鼻粘膜組織總RNA。用Nanodrop 2000儀器測量樣品總RNA濃度，并將每個配對的樣品調節至相同濃度。然后按照cDNA逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA。使用TB GreenTM Premix Ex Taq II試劑盒進行qPCR。U6和β-actin分別用作miRNA和mRNA的內部參考。使用FTC-3000p實時PCR系統完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數據。其中使用的引物見表1。

PrimerSequence(5'-3')miR-223Forward:5'-GGTGGTGAATACCCTCCTG-3'Reverse:5'-GTCTGTCCGTGGTGCTGA-3'IgEForward:5'-GGCTGGCAACATAACAGAGAA-3'Reverse:5'-CCCCACATCTATACACACCTCC -3'U6Forward:5'-AAGACGGGCGGAGAGAAACC-3'Reverse:5'-CGTTGACTCCGACCTTCACC-3'β-actinForward:5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3'Reverse:5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'

1.2.8Western blot 各組小鼠鼻粘膜組織用RIPA裂解提取總蛋白，并通過BCA方法進行定量，樣品經變性后進行上樣。按照實驗步驟進行電泳-轉膜-封閉(5%脫脂奶粉)-一抗孵育(4℃過夜)-二抗孵育(室溫1 h)-顯影曝光。Image Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 miR-223和IgE在鼻息肉患者中高表達

qPCR檢測鼻息肉患者組織中miR-223和IgE的表達水平。結果表明，與健康對照者相比，鼻息肉患者的鼻黏膜組織中miR-223的表達水平明顯增加(P<0.01)(圖1A)。同時，我們還觀察到鼻息肉患者中IgE的表達與健康對照組相比有所增加(P<0.01)(圖1B)。

圖1 miR-223和IgE在鼻息肉患者(Nasal polyps)(n=30)和健康對照者(Healthy controls)(n=30)的鼻粘膜組織中的表達

(A)qPCR檢測鼻息肉患者組和健康對照組織中miR-223的相對表達水平。(B)qPCR檢測鼻息肉患者組和健康對照組織中IgE的相對表達水平。**P<0.01與健康對照組比較

2.2 各組小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的表達水平

qPCR檢測各組小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的表達水平。結果表明，與control組比較，LPS組和miR-NC組小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的表達水平均上調(P<0.05)，miR-223 inhibitor組與control組無統計學意義(P>0.05)；miR-223 inhibitor組小鼠鼻黏膜組織中miR-223的表達水平較LPS組和miR-NC組顯著下調(均P<0.001)(圖2A)；同時，我們還觀察到miR-223 inhibitor組小鼠粘膜組織中IgE的表達與LPS組和miR-NC組相比顯著下降(均P<0.001)。 (圖2B)。

2.3 各組小鼠嗅覺功能評估

食物埋藏實驗檢測各組小鼠的嗅覺水平。結果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠找到食物小球的時間均顯著增加(P<0.001)；miR-223 inhibitor組小鼠找到食物小球的時間較LPS組和miR-NC組減少(均P<0.05)(圖3)。

圖2 miR-223和IgE在各組小鼠鼻粘膜組織中的表達

圖3 食物埋藏實驗檢測各組小鼠嗅覺水平

2.4 各組小鼠鼻粘膜組織病理變化

HE染色檢測各組小鼠鼻粘膜組織的病理變化。結果表明，與control組比價，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠均出現息肉樣病變，鼻腔粘膜息肉數量均顯著增加(P<0.001)；miR-223 inhiitor 組小鼠鼻腔粘膜息肉和上皮破壞數量較LPS組和miR-NC組明顯減少(均P<0.01)(圖4)。

2.5 各組小鼠鼻粘膜組織中MPO和OMP的表達情況

免疫組織化學檢測各組小鼠鼻腔和鼻竇中的炎性細胞和嗅覺上皮的變化。結果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數量均明顯增多(P<0.01)，OMP+細胞數量均明顯減少(P<0.05)；miR-223 inhibitor組較LPS組和miR-NC組相比，小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數量減少(均P<0.05)，OMP+細胞數量明顯增加(均P<0.01)(圖5)。

圖4 HE染色檢測各組小鼠鼻粘膜組織的變化

圖5 免疫組織化學檢測各組小鼠鼻粘膜組織中MPO和OMP的表達水平

2.6 各組小鼠鼻腔灌洗液中細胞因子的表達水平

ELISA檢測各組小鼠鼻腔中細胞因子的表達。結果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔灌洗液中IgE、TNF-α、IL-6的表達水平均升高(P<0.05)；miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔灌洗液中IgE、TNF-α、IL-6的表達水平較LPS組和miR-NC組均降低(P<0.05)。

圖6 ELISA檢測各組小鼠鼻腔灌洗液中細胞因子的表達情況

2.7 各組小鼠鼻粘膜組織中IgE蛋白表達情況

Western blot檢測各組小鼠鼻粘膜組織中IgE的表達情況。結果表明，與control組比較，LPS組、miR-NC和miR-223 inhibitor組小鼠鼻粘膜組織中IgE蛋白的表達水平均上調(P<0.05)；miR-223 inhibitor組小鼠鼻粘膜中IgE蛋白的表達水平較LPS組和miR-NC明顯下調(均P<0.01)。

3 討論

鼻息肉(Nasal polyps)是上呼吸道的一種常見疾病，常見的癥狀為鼻塞、嗅覺喪失、頭痛和面部疼痛等，嚴重影響患者的生活質量[7]。根據受影響的炎癥細胞的不同，鼻息肉分為兩種類型：一種類型主要由嗜酸性粒細胞為主，另一種類型主要由嗜中性粒細胞為主。每種類型都具有不同的免疫組織病理學特征[8]。鼻息肉的病理機制尚不完全清楚，涉及多種因素，例如病毒、細菌、真菌和過敏原等。盡管使用鼻內皮質類固醇激素和功能性內窺鏡鼻竇手術可顯著提高鼻息肉的治愈率，但約有10%的患者在手術后仍經歷復發性鼻息肉[9]。因此，鼻息肉的病理機制需要進一步闡明。

圖7 Western blot檢測各組小鼠鼻粘膜組織中IgE蛋白表達情況

IgE在鼻息肉的發生發展中起著重要的作用，“IgE介導的過敏”發炎反應引起紅腫、癢、疼痛，甚至是鼻炎等各種過敏癥狀。最近的一些研究報告表明，IgE在鼻息肉中的定量水平增加，發生嚴重的嗜酸性炎癥[4]。但是，IgE介導的鼻息肉促炎反應的調控機制仍有待充分研究。

microRNA(miRNA)是一類短的非編碼RNA，通過靶向miRNA的3′非翻譯區(3′UTR)來誘導信使RNA(mRNA)降解或翻譯抑制，從而對基因表達進行負調控[10]。目前，已經有1000多種miRNA在RNA數據庫中鑒定并報告了這些RNA，其中許多被用作診斷，預后和治療的分子生物標記物[11,12]。微小RNA參與不同的細胞功能，包括分化，生長，增殖和凋亡[12]。miRNA廣泛參與免疫反應，例如免疫細胞的成熟和分化、自然免疫反應等。研究表明，miR-223在變態反應疾病中的研究中目前處于熱門，有研究通過使用蛋白芯片檢測鼻息肉模型小鼠中不同的類型miRNA的表達差異，最終發現miR-223在各種鼻息肉模型中均有不同程度的高表達。因此，miR-223可能是治療鼻息肉的潛在靶點。

本實驗中，我們先進行了qPCR法檢測了miR-223和IgE在鼻息肉患者和鼻息肉小鼠鼻粘膜組織中miR-223和IgE的差異表達，結果表明，miR-223和IgE在鼻息肉患者和鼻息肉小鼠鼻粘膜組織中表達顯著上調，miR-223 inhibitor能抑制miR-223和IgE的表達。食物埋藏實驗中，我們發現LPS組小鼠找到食物小球的時間較control組顯著增加，出現明顯的嗅覺障礙；與LPS組相比，miR-223 inhibitor組小鼠找到食物小球的時間較LPS組小鼠減少；HE染色結果表明，LPS組小鼠明顯觀察到息肉樣病變且帶有息肉樣病變的粘膜增厚，miR-223 inhiitor 組小鼠鼻腔粘膜息肉和上皮破壞數量減少；提示鼻息肉小鼠造模成功，敲低miR-223可抑制鼻息肉的發展。免疫組織化學檢測結果表明，LPS組小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數量顯著增多，OMP+細胞數量顯著減少；miR-223 inhibitor組較LPS組相比，小鼠鼻腔和鼻竇中MPO+細胞數量減少，OMP+細胞數量明顯增加，提示敲低miR-223可能抑制炎癥的發展，改善鼻息肉小鼠的嗅覺功能。ELISA檢測結果表明，LPS組小鼠鼻灌洗液中的IgE、TNF-α、IL-6表達水平顯著上調，與LPS組相比，miR-223 inhibitor組小鼠鼻腔中IgE、TNF-α、IL-6的表達水平降低，提示敲低miR-223可能抑制細胞因子的表達。Western blot結果表明，敲低miR-223可下調IgE蛋白的表達，提示miR-223可能調控IgE的表達。

綜上所述，miR-223在鼻息肉的發生發展過程中起著重要作用，敲低miR-223可能下調IgE的表達、抑制鼻息肉的生成及減輕炎性反應。因此，miR-223可能通過調控IgE的表達來影響鼻息肉形成相關細胞因子的釋放從而調控鼻息肉的發展，但具體的機制應進一步研究。