miR-200a在TGF-β誘導口腔黏膜修復中的功能研究

代冬 馮小東

口腔黏膜是由口腔上皮細胞、成纖維細胞和細胞外基質組成的黏膜屏障系統，可有效抵御病原體，是維護口腔健康的第一道屏障[1]。然而，口腔黏膜常受到局部物理性傷害，引發破損、潰瘍等損傷[2]。研究發現，口腔黏膜創面形成后可激活固有免疫細胞，如單核-巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等，并產生大量炎癥因子，引發局部的炎癥反應[3-5]。其中，TGF-β在促進口腔黏膜重建和修復的過程中發揮了重要作用[3，6-7]。TGF-β可通過刺激口腔黏膜成纖維細胞增殖和遷移以促進傷口修復，但對口腔黏膜成纖維細胞活性的調控機制還不完全清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源基因表達的非編碼RNA，可通過與下游靶基因的mRNA形成特定的配對位點，調控下游基因的表達水平，影響多種細胞生理活動[8]。miR-200a是miR-200家族中的主要成員，在TGF-β信號轉導通路中具有重要作用[9]，但是否參與口腔黏膜修復和重建的調控還不清楚。本研究利用人牙齦成纖維細胞(Human Gingival Fibroblast，HGF)，對TGF-β誘導口腔黏膜修復過程中miR-200a的表達及功能進行初步研究。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器

DMEM高糖培養基、胎牛血清、Trypsin-EDTA胰酶消化液(ThermoFisher公司，美國)；M-MLV逆轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；重組人轉化生長因子β(R&D公司，美國)；Lipofectmine RNAiMAX轉染試劑、TRIzol(Invitorgen公司，美國)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(同仁化學，日本)，Transwell細胞培養小室(BD公司，美國)。

1.2 健康牙齦標本采集及原代HGF培養

收集本院口腔科因手術拔除阻生第三磨牙而切除的牙齦組織。入組標準：①年齡≤30周歲；②無口腔癌和牙周病；③無全身系統性疾病。手術切除的新鮮牙齦組織以4 ℃預冷的含有1%青霉素-鏈霉素的HBSS沖洗，去除殘留血凝塊，并用眼科剪修剪成為5 mm3大小的方塊，隨后加入1 U/mL的Dispase Ⅱ分散酶，置于4 ℃冰箱中靜置16 h。次日，小心分離牙齦組織的表皮層、血管等組織，加入0.25%Trypsin-EDTA，放置于37 ℃培養箱消化30 min后，加入胎牛血清終止消化，1 000 r/min離心5 min，使用含有10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素的DMEM培養基重懸細胞，培養于60 mm細胞培養皿中。待細胞充分貼壁后換液，去除懸浮的組織碎片。每天換液，每3天傳一代。第3代HGF用于后續實驗。

1.3 細胞總RNA提取

第3代HGF分別加入終濃度0、5、10、20、40 ng/mL的重組人TGF-β處理24 h，經Trypsin-EDTA消化分離細胞，加入500 μL TRIzol，室溫靜置20 min，隨后加入100 μL三氯甲烷，充分混勻后12 000 g離心10 min，取200 μL上清，加入等體積異丙醇，12 000 g離心10 min，沉淀的總RNA用70%乙醇清洗2遍，晾干后加入50 μL DEPC水充分溶解。

1.4 實時熒光定量PCR

取0.5 μg總RNA，利用M-MLV逆轉錄試劑盒合成cDNA，隨后使用羅氏SYBR Green qPCR Mix，以逆轉錄方式得到的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測。對miR-200a的定量檢測使用U6為對照內參，反應所需的引物序列為：miR-200a正向引物5’-CCTACGCCACAATTAACAAGCC-3’；miR-200a反向引物5’-GCCGTCTAACACTGTCTGGTA-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；U6反向引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCG -3’。

1.5 實驗分組及細胞轉染

將第3代HGF分為空白組、對照組和實驗組。對照組和實驗組均加入20 ng/mL TGF-β預處理12 h，隨后對照組轉染隨機序列miRNA，實驗組轉染miR-200a模擬物，空白組不予TGF-β刺激及轉染操作。miRNA的轉染使用Lipofectmine RNAiMAX轉染試劑，miRNA及轉染試劑使用量參照轉染試劑操作說明，依據每次轉染的細胞數確定。

1.6 Transwell細胞遷移實驗

Transwell小室預先加入500 μL終濃度為10 μg/mL的Fibronectin溶液于24孔板中，讓小室下層基底膜充分接觸Fibronectin溶液，37 ℃孵育2 h。隨后將小室取出，PBS清洗2次。將各組細胞消化并使用無血清DMEM培養基重懸，調整細胞濃度為1×106cells/mL，上層小室加入200 μL細胞懸液，下層小室加入含有10%胎牛血清的DMEM完全培養基。37 ℃培養18 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦拭上層小室中未遷移的細胞，然后將小室基底膜放置于4%多聚甲醛溶液中，室溫下固定15 min，PBS清洗后結晶紫溶液染色20 min，PBS清洗3次，小心取下基底膜，鏡下觀察拍照，并統計每個視野中遷移的細胞數目。

1.7 CCK-8檢測細胞增殖

空白組、對照組和實驗組HGF消化離心并重懸，取2×104個細胞接種于96孔板中，每組設置3個復孔。待細胞充分貼壁后，于0 h、24 h和48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標儀讀取450 nm處的吸光度值。

1.8 蛋白質免疫印跡實驗

離心收集HGF，用預冷的PBS清洗1遍，加入200 μL RIPA細胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，待樣品冷卻后使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，后轉到0.45 μm PVDF膜上。轉印蛋白樣品的PVDF膜先用5%脫脂牛奶封閉40 min，后依次孵育一抗和HRP偶聯的二抗各1 h后，加入顯色底物，使用凝膠成像儀獲取顯影圖像，使用Gel Pro軟件對蛋白顯影條帶進行灰度值定量分析。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度TGF-β對HGF中miR-200a表達的影響

與無TGF-β處理組(0 ng/mL)相比，TGF-β處理的HGF中miR-200a表達水平顯著下降，且隨著TGF-β作用濃度提高，表達下降比例增加，具有明顯的劑量依賴效應(圖1)。

2.2 細胞轉染對HGF中miR-200a表達水平的影響

與空白組相比，對照組miR-200a表達水平顯著下降(P<0.05)；與對照組細胞相比，實驗組miR-200a表達水平顯著上升(P<0.05)(圖2)。

a：與空白組相比，P<0.05；b：與對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group, P<0.05; b: compared with control group, P<0.05圖2 各組細胞miR-200a表達水平比較Fig. 2 The expression level of miR-200a in each group

2.3 過表達miR-200a對HGF增殖活性的影響

與空白組相比，經TGF-β處理的對照組HGF在24 h和48 h時間點檢測的細胞增殖活性顯著上升(P<0.05)；而與對照組相比，轉染miR-200a模擬物的實驗組HGF在24 h和48 h檢測的細胞增殖活性顯著下降(P<0.05)(圖3)。

a：與同一時間點空白組相比，P<0.05；b：與同一時間點對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group at the same time point, P<0.05; b: compared with control group at the same time point, P<0.05圖3 各組細胞增殖活性分析Fig. 3 The proliferation activity of HGF cells in each group

2.4 過表達miR-200a對HGF遷移能力的影響

與空白組相比，對照組HGF遷移到下層小室的數量明顯上升(P<0.05)；與對照組相比，實驗組HGF遷移到下層小室的數量明顯下降(P<0.05)，表明過表達miR-200a會影響細胞遷移(圖4)。

a：與空白組相比，P<0.05；b：與對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group, P<0.05; b: compared with control group, P<0.05圖4 Transwell實驗檢測各組細胞遷移能力Fig. 4 The migration capability of HGF cells in each group

2.5 過表達miR-200a對HGF中Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達的影響

蛋白質免疫印跡實驗結果表明，與空白組相比，對照組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達水平均顯著上升(P<0.05)；與對照組相比，轉染miR-200a模擬物的實驗組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達水平均顯著下降(P<0.05)(圖5)。

a：與空白組相比，P<0.05；b：與對照組相比，P<0.05 a: compared with blank group, P<0.05; b: compared with control group, P<0.05圖5 各組細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達水平Fig. 5 The expression levels of collagen Ⅰ and Ⅲ in each group

3 討論

創面愈合是皮膚、黏膜等在損傷后自發進行的一系列自我保護的生理過程，機體各個組織的創面愈合過程基本一致，都涉及到炎癥反應、組織再生等生理活動，并且通過一個快速的修復過程避免機體的進一步損害，這一過程被高度有序地調控，然而其調控機制還不清楚[10]?？谇火つび捎谔幱诟缓⑸锏臐駶櫗h境中[2]，其創面愈合重建的過程與皮膚相比可能有不同的調控機制。研究發現，miR-2053可以通過影響Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白以及金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3的表達，影響HGF的遷移和增殖，進而影響口腔黏膜修復[11]。

口腔黏膜創傷愈合過程中，炎癥因子發揮了重要的作用[6]。研究表明，口腔黏膜損傷后TGF-β表達水平上升，但其參與口腔創傷愈合和黏膜重建的機制尚未明確。本研究發現，在20 ng/mL TGF-β處理后，HGF的miR-200a表達水平下調，提示miR-200a可能在TGF-β信號通路下游發揮了重要作用。TGF-β在腫瘤和炎癥反應中都發揮了重要的作用，但對細胞功能的調控作用在不同組織中或疾病的不同階段都不盡相同。TGF-β信號轉導主要是通過胞漿蛋白Smad的磷酸化介導的，TGF-β與膜受體結合，促進Smad蛋白發生磷酸化修飾，Smad蛋白N端MH1結構域具有DNA結合功能，而C端MH2結構域則可以與其他轉錄因子結合，激活TGF-β下游信號轉導蛋白的轉錄[12]。關于TGF-β下游信號通路與miRNA的研究表明，TGF-β在促進或抑制某些miRNA的成熟中發揮了重要作用[13-14]。miR-200家族包括5個成員，即miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。研究顯示，在TGF-β誘導的腫瘤細胞上皮-間質轉化過程中，miR-200家族成員的表達都顯著下調。miR-200a可以抑制E-cadherin轉錄抑制因子ZEB1和ZEB2的表達，TGF-β通過下調miR-200a并增加ZEB2的表達水平，促進腫瘤細胞的遷移和浸潤[15-16]?？谇火つば迯瓦^程中，成纖維細胞通過自身增殖、遷移來促進創口愈合，并通過表達膠原蛋白以促進基質的重建。在該過程中，TGF-β可以促進成纖維細胞的增殖和遷移、調控炎癥反應、促進血管新生并促進膠原蛋白合成以重建細胞外基質，對口腔黏膜修復發揮了重要作用。本研究發現，HGF過表達miR-200a可以顯著抑制TGF-β誘導的細胞增殖和細胞遷移，并可以抑制牙齦成纖維細胞表達Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白。這些結果提示，在口腔黏膜修復過程中，miR-200a可以作為TGF-β信號通路重要的調控因子，影響牙齦成纖維細胞的功能。本研究為揭示TGF-β調控口腔黏膜修復重建的機制提供了新的研究基礎。