第三代超聲輔助吸脂獲取的hADSCs構建組織工程軟骨的實驗研究

王健 周栩

小耳畸形是常見的先天性體表畸形，嚴重影響患者身心健康，耳郭再造是目前最有效的治療手段，其關鍵是耳郭軟骨支架的制備。目前，常采用自體肋軟骨制備耳郭支架。組織工程的發展為耳郭再造提供了新的途徑。脂肪干細胞(Adipose tissue derived stromal/stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離提取的具有多向分化潛能的成體干細胞。研究發現，ADSCs具有成軟骨分化并形成軟骨樣組織的能力[1-3]。與BMSCs 相比，ADSCs具有來源廣、易獲得、創傷小、純化率高、體外增殖速度快等優點，是構建組織工程軟骨的理想種子細胞。

現有證據表明，不同的脂肪收獲方法可能影響脂肪組織中ADSCs的質量和再生潛力[4]。超聲輔助吸脂(Ultrasound-assisted liposuction，UAL)已在臨床廣泛應用，其基本原理是將電能轉化為振動，引起熱效應、空泡效應和機械效應，從而導致脂肪碎裂[5-7]。但目前尚不清楚超聲輔助吸脂所獲取的hADSCs對構建組織工程軟骨是否存在不利因素，因此本研究通過第三代超聲輔助吸脂獲取hADSCs，并與殘耳軟骨細胞共培養，觀察其在體內構建組織工程軟骨的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

6周齡雌性裸鼠6只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。

PLA、油紅O工作液、茜素紅(Sigma，美國)；Ⅰ型膠原酶(Invitrogen，美國)；10%FBS(Gibco，美國)；完全成脂培養基A、完全成脂培養基B、完全軟骨分化培養基、完全成骨分化培養基(Cyagen，美國)；組織糖胺多糖總含量阿利辛藍比色法定量檢測試劑盒(上海杰美基因醫藥科技有限公司)。

培養箱(Thermo，美國)；生物力學分析儀(Instron 5967，美國)。

1.2 人耳軟骨細胞的獲取和培養

來源于小耳畸形患者術中廢棄的殘耳軟骨，均獲患者知情同意。取術中廢棄的殘耳軟骨組織，去除軟骨膜及周圍組織，將殘耳軟骨塊剪成1 mm3碎塊，加入0.15%膠原酶，37 ℃搖床消化10～12 h，200目濾網過濾，2 000 r/min離心8 min，去上清后加入完全培養基重懸，計數后以1×104cells/cm2的細胞濃度接種于培養皿中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養。每3天換液一次，待軟骨細胞生長至75%～80%融合時傳代[8-9]，收集第2代細胞備用。

1.3 ADSC的分離、培養

脂肪移植物采集自10名要求進行吸脂塑形的健康女性志愿者。實驗通過北京協和醫學院倫理委員會審批，所有志愿者術前均簽署知情同意書。抽脂部位選取同一患者的雙側大腿，左側大腿使用第三代超聲輔助抽脂，右側大腿使用常規負壓抽脂。局部腫脹麻醉后，第三代超聲輔助抽脂技術采用3.7 mm、3環探頭在50%功率下連續模式乳化脂肪，當幾乎感覺不到阻力時停止乳化。常規負壓抽脂采用3.7 mm長吸脂管進行常規負壓脂肪抽吸(-0.5 bar)。獲取脂肪組織后，剝除肉眼可見的筋膜、小血管等脂肪周圍組織，剪成1 mm3大小組織塊，加入終濃度為 0.075%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃搖床內消化40 min，加入含10%FBS的低糖 DMEM 培養基終止消化，200目濾網過濾，1 500 r/min離心5 min，去上清后加入完全培養基重懸，計數后以5×104cell/cm2的細胞濃度接種于培養皿內，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養。每3天換液一次，待細胞融合達85%后傳代，收集第3代細胞備用。

1.4 hADSCs誘導分化及檢測

1.4.1成脂分化誘導

37 ℃的6孔板中加入第3代hADSCs，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養，直到細胞達到100%融合。將原培養基替換為2 mL完全成脂培養基A培養3 d，然后替換為完全成脂培養基B培養 24 h。培養基A和B重復交替3個周期。用10%中性甲醛固定30 min，1 mL油紅O工作液染色10 min，顯微鏡下觀察細胞。

1.4.2成骨分化誘導

取第3代hADSCs，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養，直到細胞融合達 80%～90%，替換為2 mL完全成骨分化培養基，每3天更換1次培養基。3 周后用10%中性甲醛固定30 min，1 mL茜素紅染色5 min，顯微鏡下觀察細胞。

1.4.3成軟骨分化誘導

取第3代hADSCs接種于離心管中，加入完全軟骨分化培養基，平均每管細胞數為2×105個。每3天更換1次培養基。在誘導培養基中培養4周后，固定細胞，石蠟切片，阿爾新藍50～60 ℃染色15 min，顯微鏡下觀察細胞。

1.5 材料支架的制作

取無紡PGA，均勻嵌入預制的圓柱狀(直徑5 mm、厚度1 mm)模具內，滴加含0.5%PLA的二氯甲烷溶液約50 μL，待其自然干燥后，用75%乙醇浸泡8 h，PBS洗滌3次，含10%FBS低糖DMEM培養基預培養過夜，準備接種細胞。共制作支架36個。

1.6 細胞-支架復合物的體外培養及分組

實驗分為3組，每組12個細胞-支架復合物。對照組1(MC)，接種單純殘耳軟骨細胞，細胞濃度為 5.0×107cells/mL。對照組2(Co-culture 1)，接種第2代殘耳軟骨細胞+常規負壓抽脂獲取的第3代hADSCs(1∶1)共培養，細胞濃度為 5.0×107cells/mL；實驗組(Co-culture 2)，接種第2代殘耳軟骨細胞+第三代超聲輔助抽脂獲取的第3代hADSCs(1∶1)共培養，細胞濃度為 5.0×107cells/mL。3組細胞-支架復合物均置于含10%FBS的DMEM培養液中培養，每周換液3次，體外培養4周后，每組取6個標本進行相關檢測，剩余6個植入裸鼠體內。

1.7 裸鼠體內移植

每只裸鼠皮下分別植入對照組、實驗組1和實驗組2的細胞-支架復合物各1個，共6只裸鼠。對照組植入左背上部，實驗組1植入左背下部，實驗組2植入右背下部。體內植入8周后取出進行檢測。

1.8 相關評價指標的檢測

對體外培養4周和體內培養8周的各組標本進行大體觀察，包括新生組織的形態、大小和色澤，并進行稱重。

阿利辛藍比色法檢測上述各組標本的糖胺多糖(GAG)含量。

將各組標本以 4%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片。HE染色觀察細胞基本形態和組織結構；甲苯胺藍染色及 Safranin O 染色觀察軟骨組織的異染程度及基質中 GAG 的分泌情況；Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察各組標本Ⅱ型膠原表達情況。

應用生物力學分析儀對各組標本進行彈性模量檢測，以最大負荷250 N、0.3 mm/min的位移速度加壓，計算新生組織的彈性模量。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 殘耳軟骨細胞形態學觀察

原代殘耳軟骨細胞約12～24 h貼壁，48 h后開始增殖。細胞剛貼壁時為圓形，伸展后呈多角形，類似于同源細胞群的生長方式形成獨立的小群體，中央密集處可形成軟骨樣結節。一般8～10 d可達90%以上的匯合狀態。傳代后細胞生長速度加快，4 d即可接近匯合狀態，可繼續傳代。殘耳軟骨細胞隨傳代出現偽足狀細胞突起，呈現出更加明顯的長梭形外觀(圖1)。

A：殘耳軟骨；B：殘耳軟骨細胞. A: Microtia ear cartilage; B: Microtia chondrocytes.圖1 殘耳軟骨與殘耳軟骨細胞Fig. 1 Microtia ear cartilage and microtia chondrocytes

2.2 hADSCs形態觀察

第三代超聲輔助抽脂和常規負壓抽脂獲取的hADSCs接種48 h后都可見大部分細胞開始貼壁，為多角形的單層細胞,有的細胞體細長似成纖維細胞。72 h后大多數細胞貼壁，并開始伸展、分裂，呈梭形。5～7 d后細胞逐漸分裂、融合成單層并鋪滿底部。細胞平均傳代擴增時間約為3 d，第3代細胞分裂增殖旺盛，細胞細長，排列緊湊且規律(圖2)。

A：UAL和SAL抽脂部位；B：UAL提取的hADSCs；C：UAL和SAL抽取的脂肪；D: SAL提取的hADSCs A: Liposuction area of UAL and SAL; B: hADSCs obtained by UAL; C: Adipose tissue obtained by UAL and SAL; D: hADSCs obtained by SAL圖2 通過UAL和SAL獲取hADSCsFig. 2 hADSCs obtained by UAL and SAL

2.3 hADSCs的定向誘導分化

成脂誘導分化72 h后，鏡下可見細胞立體感增強，細胞內有小脂滴出現，約1周后脂滴數量增加并相互融合，細胞由長梭形變為圓形或多邊形，誘導第11天時，細胞分化達到高峰，可見大量脂滴融合成團，油紅O染色陽性，顯示有大量脂質沉淀(圖3B、E)。

A：SAL提取的hADSCs成骨分化；B：SAL提取的hADSCs成脂分化；C：SAL提取的hADSCs成軟骨分化；D：UAL提取的hADSCs成骨分化；E：UAL提取的hADSCs成脂分化；F：UAL提取的hADSCs成軟骨分化。 A: Osteogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; B: Adipogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; C: Chondrogenic differentiation of hADSCs obtained by SAL; D: Osteogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL; E: Adipogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL; F: Chondrogenic differentiation of hADSCs obtained by UAL圖3 hADSCs的鑒定Fig. 3 Identification of hADSCs

成骨誘導分化第4天時，細胞呈多角形，胞質內細胞顆粒增多；第8天時胞質內充滿顆粒，細胞呈集落樣生長，細胞間見鈣質沉積；第12天時細胞結節中心的細胞逐漸融合失去細胞結構，鈣結節形成明顯；第14天時誘導分化達到高峰，可見大量鈣沉積，并融合成片，茜素紅染色陽性，呈紅色結節(圖3A、D)。

成軟骨誘導分化24 h后，細胞呈小顆粒狀漂浮在誘導液中，單個細胞形態無明顯變化。隨誘導時間延長，在密度較大處細胞逐漸聚集成群；誘導第7天即可在聚集細胞的表面看到微黃色的物質積累，量逐漸增多；誘導第21天時達到高峰，阿爾新藍染色陽性(圖3C、F)。

2.4 體外培養4周時的細胞-支架復合物的大體、組織學觀察

體外培養4周后，大體觀察可見3組細胞-支架復合物均形成了類軟骨組織，呈微黃色、略有光澤，較薄。組織學觀察可見對照組1、對照組2與實驗組均未形成基質飽滿的類軟骨組織，組織結構疏松，類似細胞-材料復合物生長的早期階段，僅有少量新生基質的生長包裹，呈現軟骨特異性ECM沉積，仍有未降解的PGA支架材料。番紅O染色、Ⅱ型膠原染色、甲苯胺藍染色都可見稀少的新生基質，分別表現為淡染的紅色、黃色、藍色(圖4)。

2.5 體內培養8周時的細胞-支架復合物的大體、組織學觀察

體內培養8周后取材，大體觀察可見3組細胞-支架復合物均形成了與原支架等大的類軟骨組織，色微黃，觸之有彈性。組織學觀察顯示，對照組1軟骨組織不均一，大部分區域形成成熟的軟骨組織，可見大量的軟骨陷窩和細胞外基質分泌，但有部分區域組織結構疏松，軟骨特異性ECM分泌較少；對照組2與實驗組均形成成熟的軟骨組織，結構均一，可見大量的軟骨陷窩和細胞外基質分泌，支架材料已經完全降解。番紅O染色、Ⅱ型膠原染色、甲苯胺藍染色都顯示強陽性(圖5)。

2.6 細胞-支架復合物稱重

對各組標本進行稱重，結果顯示對照組2與實驗組均顯著優于對照組1(P<0.05)，對照組2與實驗組無顯著差異(P>0.05)(圖6 A)。

2.7 GAG含量檢測

對各組標本進行GAG含量檢測，結果顯示對照組2與實驗組均顯著高于對照組1(P<0.05)，對照組2與實驗組無顯著差異(P>0.05)(圖6B)。

圖4 體外培養4周細胞-支架復合物大體、組織學觀察。MC(對照組1)，Co-culture 1(對照組2)，Co-culture 2(實驗組)Fig. 4 Gross view and histological observation of cell-scaffold complex after cultured 4 weeks in vitro. MC(ctrl group 1)， Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

圖5 體內培養8周細胞-支架復合物大體、組織學觀察。MC(對照組1)，Co-culture 1(對照組2)，Coculture 2(實驗組)Fig. 5 Gross view and histological observation of cell-scaffold complex after cultured 8 weeks in vivo. MC(ctrl group 1)， Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

圖6 體外培養4周和體內培養8周各組濕重、GAG含量、楊氏模量的比較。MC(對照組1)，Co-culture 1(對照組2)，Co-culture 2(實驗組)Fig. 6 The comparisons of wet weight, GAG content and Young’s modulus among the 3 groups after cultured 4 weeks in vitro and 8 weeks in vivo. MC(ctrl group 1)，Co-culture 1(ctrl group 2)，Co-culture 2(Exp group)

2.8 生物力學檢測

各組標本彈性模量檢測結果顯示，體外培養4周后，3組標本力學強度都很低，對照組2與實驗組顯著優于對照組1(P<0.05)，對照組2與實驗組無差異(P>0.05)。但經過體內8周的重塑后，3組標本的彈性模量都有明顯提升，對照組2與實驗組顯著優于對照組1(P<0.05)，對照組2與實驗組無顯著差異(P>0.05)(圖6C)。

3 討論

構建組織工程軟骨耳郭最主要的問題是種子細胞的來源，小耳畸形患者的殘耳軟骨組織往往較小，不足以提供足量的殘耳軟骨細胞，而過度體外擴增將使軟骨細胞逐漸失去表型及分泌軟骨基質的能力，進而失去成軟骨能力[10-11]。而ADSCs來源廣、易獲得、純化率高、體外增殖速度快，是構建軟骨組織的理想種子細胞。ADSCs成軟骨細胞誘導的研究較多，但傳統的誘導方法需要大量生長因子，難以應用于臨床。研究發現，軟骨微環境能有效促進干細胞成軟骨分化，形成軟骨樣組織并用于修復缺損[12-13]。微環境可能的作用機制為：軟骨細胞分泌 TGF-β、IGF 等生長因子，誘導干細胞向軟骨方向分化[10]；相鄰細胞間的相互作用[11]；分泌軟骨微環境特異性細胞外基質，作用于細胞的增殖、分化、黏附及細胞間信號傳導等。研究顯示，殘耳軟骨細胞在體外獨立模擬軟骨誘導微環境，能夠誘導ADSCs定向分化并形成軟骨組織[14]。因此，本實驗采用ADSCs和殘耳軟骨細胞共培養來構建軟骨組織，濕重、糖胺多糖、生物力學檢測都顯示對照組2與實驗組均顯著優于對照組1，對照組2與實驗組間無顯著差異。組織學染色結果類似，對照組2與實驗組形成的軟骨組織結構均一，可見有大量的軟骨陷窩和細胞外基質分泌，對照組1軟骨組織不均一，有部分區域組織結構疏松，軟骨特異性ECM分泌較少。由此推斷，殘耳軟骨細胞微環境對ADSCs的軟骨方向分化具有確切的促進作用，共培養組中的ADSCs能替代一定量的殘耳軟骨細胞形成軟骨樣組織。

超聲輔助吸脂的基本原理是將電能轉化為振動，引起熱效應、空泡效應和機械效應，從而導致脂肪碎裂；超聲能量會選擇性地分解脂肪組織，對組織損傷較小，從而在減少出血的情況下實現抽脂。本實驗中超聲輔助吸脂和常規負壓吸脂獲得的ADSCs都可以進行成骨、成脂和成軟骨分化，并且超聲輔助吸脂和常規負壓吸脂獲得的ADSCs與殘耳軟骨細胞共培養都可以成功構建組織工程軟骨，兩者之間無顯著差異，表明超聲能量對ADSCs無不良影響。

綜上所述，應用第三代超聲輔助吸脂可以安全有效地獲取ADSCs，超聲能量對ADSCs無不良影響；應用第三代超聲輔助抽脂獲取的hADSCs+殘耳軟骨細胞共培養，可形成成熟的組織工程軟骨。