PGS構建特定形狀脂肪組織的可行性研究

鮑婉婷 曹麗辰 魏昊 余力 周廣東 郭善禹

全世界每年約有140萬人被診斷為乳腺癌，我國僅2015年新發的乳腺癌患者就高達27.2萬余人。根治切除導致的乳房缺失帶給患者長期的心理問題不容忽視。因此，在不斷改進乳腺癌手術方法的同時，“乳房重建”的概念日趨受到重視。除了現行的肌皮瓣轉移、硅膠假體植入以及自體脂肪移植，組織工程技術的發展也為乳房重建開辟了新的途徑，通過組織工程技術構建大體積脂肪組織在乳房再造中具有潛在的應用前景。

結合正常乳房組織特點，脂肪組織工程支架應具備一定的韌度與強度，因為不僅要抵抗細胞收縮力引起的形狀改變，還要承受在組織再生過程中的切口收縮力。此外，在睡眠和體育活動中，乳房區域也承受著較高的生物力學負荷，因此組織構建物必須有一定的剛度[1]。然而，值得注意的是，剛性支架雖然在組織再生的過程中可起到保護作用，但若造成明顯的不適感，其臨床價值也是有待商榷的。相關研究中，合成聚合物支架(如PLA、PCL等)都剛性偏大。Patric[2]認為這類聚合物多孔支架可能并非乳房組織工程的最佳選擇。材料學和工程學的發展，使制備富有彈性、可降解、力學性能接近或稍高于正常乳房乳腺組織的三維多孔支架成為可能。

聚葵二酸甘油酯(PGS)是一種新型可生物降解的彈性聚合材料[3-4]，其彈性模量介于肌腱與韌帶之間，并且細胞相容性好，動物體內周圍組織炎癥、纖維化反應輕，以表面侵蝕的方式降解，不伴有膨脹或變形。基于以上良好的生物學及力學性能，PGS主要應用于軟組織替代以及軟組織工程，比如心肌[5]、神經[6]、角膜修復[7]、動脈重建[8]、軟骨組織工程[9]、鼓膜修補[10]等。然而，鮮有報道將其用于脂肪組織工程領域。

本研究將探討PGS支架構建大體積特定形狀脂肪組織的可能性，以期為乳腺癌術后采用組織工程技術構建乳房奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

低糖DMEM培養液、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、胎牛血清(Gibco，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；成脂誘導分化培養基試劑盒、成骨誘導分化培養基試劑盒(Cyagen，美國)；SEM(Philips XL-30，荷蘭)；生物力學分析儀(Instron，美國)；PGS支架(上海銳圖生物材料有限公司)。

1.2 實驗動物

4周齡雌性裸鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)。本實驗遵守實驗動物倫理原則。

1.3 PGS支架的制備及表征分析

PGS用四氫呋喃溶解，按PGS∶鹽=9∶1加入經標準篩過篩后的標準鹽(粒徑224～300 μm)，充分攪拌均勻后，清洗去除溶劑。將可流動的共混物加入定制的半球形模具中，待成型后脫模，用去離子水進行鹽析處理。

掃描電鏡觀察多孔支架內部結構與形態，測量孔徑大小。支架的孔隙率按照稱重法進行測量：①比重瓶裝滿乙醇稱重為W1；②支架稱重Ws, 完全浸入比重瓶乙醇中使其充分浸透；③加滿比重瓶中乙醇，稱重W2；④取出支架，剩下部分稱重W3。支架孔隙率E=(W2-W3-Ws)/(W1-W3)×100%。

1.4 脂肪及脂肪干細胞(ADSCs)的獲取

脂肪來自于我院抽脂手術的健康成人，事先經過患者知情同意。本研究經我院倫理委員會審核通過。

抽脂獲取的脂肪采用靜置法除掉腫脹液后，按1∶1加入0.1% Ⅰ型膠原酶消化1.5 h，離心取沉淀進行原代細胞接種分離培養。3 d后，待細胞密度達80%～90%時，用0.25%胰酶消化后傳代培養。選取生長良好的第3代ADSCs行多向分化鑒定。

1.5 體外細胞黏附實驗

PGS支架經環氧乙烷消毒后，PBS預濕，置于24孔板中。選取生長良好的第3代ADSCs，消化后制成細胞懸液，細胞濃度均調整為2×105cells/mL。將1 mL細胞懸液緩慢滴加到支架表面后，24孔板放入37 ℃、5%CO2培養箱培養7 d，復合物取出后電鏡固定液固定，掃描電鏡觀察。

1.6 體內脂肪復合實驗

將抽脂獲得的脂肪組織用PBS洗滌后，剔除肉眼可見的血管和結締組織，然后用組織剪反復剪切直到呈均一勻漿狀。將組織勻漿經雙層無菌醫用紗布過濾后離心(19 g)1 min，吸棄上層油脂，余下部分振蕩混勻，將滅菌后的PGS支架浸入脂肪處理物中30 min，備用。

將空白PGS支架(對照組，n=2)以及經處理的PGS支架(實驗組，n=2)植入裸鼠背部皮下，術后4周時連同周圍組織取材行組織學檢測，HE染色和Masson染色觀察材料降解情況和組織再生情況。

2 結果

2.1 PGS支架表征分析

PGS多孔支架大致呈半球形，直徑約10 mm，厚度4 mm，疏松多孔，內部呈海綿樣結構；支架表面電鏡掃描顯示，多孔支架的孔隙分布均勻，孔徑形狀較規則，大小在200～300 μm之間(圖1)，孔隙率約為88%。

圖1 支架的大體觀察與電鏡觀察Fig. 1 Gross view and SEM observation of the scaffold

2.2 ADSCs的培養與鑒定

ADSCs原代細胞經分離培養傳代后，第3代細胞呈細長梭形，貼壁生長(圖2 A)。ADSCs具有成骨、成脂分化能力，成脂誘導培養后油紅O染色可見大量脂滴紅染(圖2B)，成骨誘導培養后茜素紅染色可見大量被紅染的礦結節(圖2C)。

A：第3代ADSCs(40×)；B：油紅O染色(100×)；C：茜素紅染色(100×) A: P3 ADSCs (40×); B: Oil red O dyeing (100×); C: Alizarin red staining (100×)圖2 ADSCs的體外培養及誘導分化。Fig. 2 In vitro culture and induced differentiation of ADSCs

2.3 體外細胞黏附觀察

ADSCs接種于PGS支架后7 d后，SEM觀察顯示，支架上可見細胞黏附并大量增殖，顯示出良好的細胞相容性(圖3)。

A、 B：PGS支架；C、D：ADSCs接種PGS支架7 d A, B: PGS scaffolds; C, D: 7 days after ADSCs seeded on the PGS scaffolds圖3 掃描電鏡觀察Fig. 3 SEM observation

2.4 動物實驗大體與組織學觀察

體內培養4周后取材，對照組PGS支架高度及直徑顯著減小，但依然維持類半球外形(圖4A、5B)，HE染色可見支架疏松多孔，內部及邊緣浸潤少量紅染的炎性細胞(圖4C)。實驗組支架高度及直徑明顯大于對照組，大體標本可見復合物表面不規則分布淡黃色的脂肪組織，組織表面有豐富的血管網(圖4D、5E)，HE染色可見支架周圍有空泡樣細胞浸潤生長，考慮為存活的脂肪細胞，復合物內部紅染的炎性細胞大量浸潤，表面有一層致密纖維組織包裹(圖4F)。

為了進一步分析實驗組的細胞浸潤生長情況，對組織切片進行Masson染色，顯示植入物周圍包裹了一層藍染的膠原纖維組織，為增生的纖維包膜(圖5A)；包膜下支架周圍浸潤生長著色淺或無的脂肪細胞，側面(圖5D)脂肪細胞浸潤面積明顯多于底部(圖5C)，底部可見到融合的大空泡，考慮脂肪壞死形成的脂滴(圖5C)。在支架內部，未見到明顯的細胞浸潤，多為支架和核深染的炎性細胞(圖5A、B)。

圖4 體內培養4周后大體及組織學觀察Fig. 4 Gross and histological observation after 4 weeks’ culture in vivo

圖5 實驗組Masson染色觀察(B、C、D標尺為500 μm)Fig. 5 Masson staining of the experimental group (Scale bars of B, C, D=500 μm)

3 討論

PGS鹽析支架蓬松，具有彈性，內部疏松多孔。在細胞相容性實驗中，ADSCs接種支架7 d后，電鏡觀察可見ADSCs在支架表面黏附并成群增殖，驗證了PGS支架良好的細胞相容性。在動物實驗中，大體和組織學觀察顯示：①PGS支架可降解，并在降解過程中基本維持原有的外形。PGS材料體內降解期約60 d，以表面侵蝕的方式進行降解，降解過程中能夠維持外形不變和表面完整而質量線性下降[4]。②體內培養4周，植入物內炎性細胞浸潤，比較對照組與實驗組浸潤情況，我們認為脂肪處理物加劇了炎癥反應。一般情況下，脂肪移植過程中會盡量除掉油份，避免誘發、加劇機體炎癥反應。同時，我們也不能排除脂肪在處理過程中被污染。③植入物表面形成纖維包膜，且實驗組較對照組更明顯。包膜攣縮是假體隆乳術后最為常見的并發癥，也有多項研究表明纖維包膜形成與假體表面材料類型、切口選擇、血腫發生、引流充分與否，以及植入區附近的亞臨床感染等因素相關[12-13]。脂肪處理物的潛在污染以及油脂誘發的炎癥滲出，都可能是導致實驗組纖維包膜厚于對照組的原因。④PGS支架僅見外周脂肪細胞浸潤生長，其側面脂肪細胞存活情況優于底面。本實驗中，采用浸沒的方式不能充分保證脂肪處理物完全滲透進支架內部，同時，可能由于支架內部缺乏血管供應，氧氣彌散距離有限，脂肪細胞即使浸潤分布到中央，存活比較困難。對于支架側面和底面脂肪細胞存活狀態的差異，機械壓力或許能夠解釋原因。當脂肪組織受到壓力時，組織間微血管壓縮或閉塞，另外有研究表明機械力本身也會抑制ADSCs向脂肪分化[14]。

從機械性能和生物相容性方面來看，PGS支架對于構建特定外形脂肪組織具有潛在的應用價值。3D打印基于計算機輔助系統(CAD)，可以制作結構和體系明確的三維定制多孔支架，能夠實現乳房外形支架的精準化和個性化。但是，由于PGS黏性較低，較少通過3D打印成型，多以靜電紡絲或傳統鹽析法制作支架[7，15-16]；并且因其固化需經高溫處理，過程繁瑣，對于制作復雜外形支架具有局限性。然而，PGS經修飾后可以獲得溫敏[17]或光敏性能[18]，能夠實現打印過程中快速即時固化。如能籍此將3D打印與PGS材料結合，就有可能制備出具有類似乳房結構的生物彈性支架而應用于乳房組織工程。