黏液型銅綠假單胞菌β-內酰胺酶的表達狀況及耐藥性研究*

王巧媚，陸丹倩，賴貴龍，彭 明

(中山市中醫院：1.檢驗科；2.綜合二區，廣東中山 528400)

銅綠假單胞菌(PA)是醫院感染的主要條件致病菌之一，根據菌落形態可以簡單分為黏液型與非黏液型，兩者在一定條件下可以相互轉化，如呼吸道和泌尿道黏膜存在慢性炎癥的刺激或醫療器械的侵入性操作時可誘使PA產生大量藻酸鹽多糖化合物、纖維蛋白等，從而形成厚而致密的生物被膜，即黏液型PA，由于生物被膜的包裹，抗菌藥物不易滲透進去，在低劑量抗菌藥物的持續刺激下更易形成誘導性耐藥，其中產β-內酰胺酶是導致其對β-內酰胺類藥物耐藥的主要原因[1-3]。本文主要研究本院分離的黏液型PA β-內酰胺酶的表達狀況及產酶與非產酶株之間的藥敏差異。

1 材料與方法

1.1菌株來源 所有菌株均分離自本院2015年1月至2018年12月臨床送檢的各類合格標本中，剔除同一患者的重復菌株共分離到82株黏液型PA，其中痰液標本75株，占95.1%；尿液標本5株，占6.1%；血液及分泌物標本各1株，分別占1.2%?；颊咧饕獊碜院粑鼉瓤疲?9.8%，平均年齡為66歲；呼吸道標本中，41.3%來自支氣管擴張合并肺部感染患者，24.0%來自慢性阻塞性肺疾病患者。

1.2儀器與試劑 所有菌株均經珠海迪爾微生物鑒定儀鑒定為PA。藥敏紙片有哌拉西林(PRL)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、氨曲南(ATM)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、慶大霉素(CN)、妥布霉素(TOB)、阿米卡星(AK)、環丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTXC)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZC)、頭孢曲松(CRO)、頭孢哌酮(CFP)、IPM+乙二胺四乙酸(EDTA)復合E-test條等，所有藥敏紙片均來自英國OXOID公司。M-H平板及化學試劑氯唑西林購自江門凱林公司。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603、ATCC1705、ATCC1706，均購自國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。

1.3藥敏鑒定方法 標本培養及分離均參照《全國臨床檢驗操作規程》第4版進行，黏液型PA經35 ℃培養18～24 h，血平板上生長多為無色、露滴樣菌落，48 h后則長大融合成一片膠糊樣菌落，部分菌株可以產生色素。藥敏采用紙片擴散法(K-B法)進行檢測，將分純后的黏液型PA配制成0.5麥氏濁度單位的菌懸液，然后均勻涂布在M-H平板上，再分別貼上12種藥敏紙片，裝進濕盒中放置35 ℃孵箱中孵育48 h后再量取其抑菌圈[4-5]。藥敏結果根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2019版進行判讀。

1.4β-內酰胺酶檢測方法

1.4.1超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs) 采用紙片擴散法的確證試驗,用CTX、CTXC、CAZ和CAZC 4種藥敏紙片進行試驗，當復合紙片CTXC或CAZC中的任何一個抑菌圈比其單獨紙片CTX或CAZ的抑菌圈大于或等于5 mm時，判定為ESBLs陽性[6]。

1.4.2C類頭孢菌素酶(AmpC)檢測 采用氯唑西林雙紙片協同試驗，將0.5麥氏黏液型PA均勻涂布于M-H平板上，中間貼一空白紙片，在距空白紙片18～26 mm處貼CRO、CTX、CAZ、CFP、ATM、FEP 6種藥敏紙片，再加20 μL氯唑西林于空白紙片上，35 ℃孵育18～24 h，氯唑西林與6種藥敏紙片中的任何一種出現協同現象則為陽性[7]。

1.4.3碳青霉烯酶檢測 (1)A類酶：又稱絲氨酸碳青霉烯酶，采用改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)[8]；(2)B類酶(MBLs):即金屬酶，采用E-test法，將0.5麥氏濁度單位的黏液型PA菌懸液均勻涂布至M-H平板上，然后貼上兩端分別是IPM和IPM+EDTA的E-test條，若組合了EDTA端的IPM的最低抑菌濃度(MIC)值較單純IPM的MIC值降低8倍或以上的，則為金屬酶陽性[9-10]。

1.5統計學處理 采用WHONET5.6進行數據統計分析，產酶與非產酶組間藥敏進行χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.182株黏液型PA的藥敏情況 12種抗菌藥物中敏感率超過70.0%的有AK、TOB、CN、MEM和CAZ這5種抗菌藥物，其中TOB和AK的敏感率最高(均為92.7%)，LEV敏感率最低(51.2%)，見表1。

表1 82株黏液型PA對12種抗菌藥物的藥敏情況[n(%)]

2.282株黏液型PA β-內酰胺酶的檢出情況及藥敏結果比較

2.2.1β-內酰胺酶的檢出情況 82株黏液型PA 中產ESBLs 12株，占14.6%，產AmpC 5株，占6.1%，產A類碳青霉烯酶(簡稱A類酶)2株，占2.4%，產MBLs 4株，占4.9%；其中有1株同時產ESBLs和AmpC，3株同時產ESBLs和MBLs。β-內酰胺酶陽性的黏液型PA共19株，占23.2%。

2.2.2產酶與非產酶組的藥敏差異 產酶與非產酶組之間的耐藥性比較，其中TZP、CAZ、ATM、LEV、CIP、PRL、FEP、IPM、MEM和CN差異有統計學意義(P<0.05)，但TOB和AK差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.2.3各產酶株的藥敏結果 19株β-內酰胺酶陽性的菌株中產ESBLs的藥敏結果較敏感，產AmpC、MBLs及A類酶的菌株對抗菌藥物的耐藥性提高，但是在所有產酶株中氨基糖苷類的耐藥性均保持較低水平，見表3。

表2 黏液型PA β-內酰胺酶的產酶組與非產酶組的耐藥情況比較[n(%)]

注：P為產酶組與非產酶組耐藥的比較。

表3 19株β-內酰胺酶陽性的黏液型PA的藥敏及耐藥表型結果(抑菌圈直徑，mm)

注：R為耐藥，I為中介，S為敏感，+為陽性，-為陰性。

3 討 論

PA廣泛分布于醫院的各種環境中，具有易定植、易變異及易產生多重耐藥的特點，可引起人體各個部位的感染[11]。本院分離的黏液型PA以呼吸道來源為主，分離率達到95.1%，患者主要分布在呼吸內科，平均年齡66歲，其中有41.3%來自支氣管擴張合并肺部感染的患者，24.0%來自慢性阻塞性肺疾病的患者，可見黏液型PA的易感人群主要是患有慢性呼吸道疾病的中老年患者。臨床分布的特點與國內相關的報道一致[12-13]。這可能跟中老年人的自身抵抗力下降、氣道保護機能退化和廣譜抗菌藥物的長期暴露等原因有關。本院的黏液型PA對12種抗菌藥物的耐藥率較低，僅PRL、FEP和LEV的耐藥率超過30.0%，藥敏結果與國內其他報道相近[13-14]。黏液型PA的體外藥敏結果都表現出較敏感，但藥敏試驗結果常出現與臨床療效不一致的情況，主要原因是黏液型PA外層包裹的厚而致密的生物被膜可阻礙抗菌藥物向膜內滲透，導致膜內細菌無法被殺滅從而治療失敗引起慢性持續性感染[15]。有研究顯示，即使在感染部位的抗菌藥物濃度達到有效藥物濃度的1 000倍以上也難以穿過生物被膜殺死細菌[16]，也正是如此，在低劑量抗菌藥物的持續刺激下黏液型PA較非黏液型PA更容易產生耐藥。

PA的耐藥機制非常復雜，主要包括產生滅活酶、作用靶位的改變、外膜的通透性降低、外排泵及生物被膜的形成等[17]。PA對β-內酰胺類藥物耐藥的主要原因是產β-內酰胺酶，在PA中幾乎發現所有類型的β-內酰胺酶，包括ESBLs、AmpC和碳青霉烯酶[18]。本院分離的82株黏液型PA中產β-內酰胺酶的有19株，分離率為23.2%，其中ESBLs的檢出率最高，為12株(14.6%)，其次是AmpC檢出5株(6.1%)。諸葛寶忠等[19]報道，黏液型PA的4種β-內酰胺酶中最高的為AmpC(28.3%)。這差異可能跟醫生的用藥習慣、地域耐藥流行株不同等有關。

從產酶株與非產酶株的兩組藥敏比較來看，產酶株對β內酰胺類和氟喹諾酮類藥物的耐藥率均高于非產酶株；產酶株中耐藥率低于30.0%的藥物有MEM(19.0%)和3種氨基糖苷類(CN、TOB和AK，均為15.8%)，可以作為產酶株的首選藥物選用。在19株產ESBLs的黏液型PA中,有8株單產ESBLs，其對12種抗菌藥物都比較敏感，其中有2株僅對IPM表現出不敏感，可能是合并了膜孔蛋白OprD2的表達減少或缺失，因為OprD2孔道是IPM快速進入菌體的特異性通道，當OprD2蛋白減少或缺失時PA僅對IPM耐藥，其他β-內酰胺類可以表現為敏感[20-21]。AmpC是典型的誘導酶，可以水解氨基青霉素和大部分早期的頭孢菌素，通常其表達水平很低，當大量使用β-內酰胺類抗菌藥物(尤其是IPM)時，PA染色體中的AmpC的表達水平可能提高100～1 000倍[22]；從AmpC陽性的5株菌的藥敏結果來看，除了碳青霉烯類比較敏感外，其他β-內酰胺類都尤為耐藥，氟喹諾酮類亦表現出了較高的耐藥性，而TOB和AK敏感率較好，所以本院對于產AmpC黏液型PA的治療可以首選IPM、MEM、TOB和AK。但是也要嚴格落實好抗菌藥物分級管理制度，避免碳青霉烯類抗菌藥物的過度使用以減少誘導性耐藥的發生。碳青霉烯酶根據分子分類法可以分為兩類：(1)一類屬于Ambler A類，Bush 2f組，其活性部位具有絲氨酸結構，又叫絲氨酸碳青霉烯酶(簡稱A類酶)，從2株產A類酶的藥敏結果來看，對試驗中的7種β-內酰胺類均為耐藥，而氨基糖苷類和氟喹諾酮類表現為敏感。(2)另一類屬于Ambler B類，Bush 3組，即MBLs,可水解包括碳青霉烯類在內的幾乎所有β-內酰胺類抗菌藥物(單環內酰胺類ATM除外),本實驗中分離的4株產MBLs的菌株耐藥率很高，但氨基糖苷類敏感性較佳，可以作為治療產MBLs黏液型PA的首選藥物；此外，它們對ATM均出現了不敏感，有可能合并了外排泵或外膜通透性下降等其他的耐藥機制，具體原因還需要進一步的研究證實。

細菌耐藥表型的檢測在臨床實驗室開展起來比較方便，但是也有它的局限性，因為細菌的耐藥機制比較復雜多變，各個耐藥類型可以同時交叉產生，而且還存在假陽性和假陰性的情況。而基因檢測的方法可以很好地解決這個問題，由于目前基因檢測的費用還相對比較昂貴，難以在實驗室常規開展，所以期望有更經濟便捷的方法能夠普及。此外，黏液型PA這幾種耐藥類型的耐藥基因均可以通過質粒、整合子等手段在菌株間傳播擴散[16,23]，所以醫院內感染控制應加強這方面的監控和管理。

4 結 論

綜上所述，本院黏液型PA產β-內酰胺酶的類型主要以ESBLs為主，且產酶株比非產酶株的耐藥率明顯提高，臨床在使用β-內酰胺類抗菌藥物治療該菌引起的感染時，應注意其各個耐藥表型的特點，合理使用抗菌藥物以減緩其誘導性耐藥的發生。同時，院內應加強黏液型PA β-內酰胺酶的監測，了解其科室分布狀況及耐藥趨勢，以便采取及時有效的措施控制其院內感染的廣泛擴散。