人骨堿性磷酸酶基因啟動子的克隆及高水平尿酸對其活性影響的實驗研究*

田民杰,徐華國

(1.南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部，江蘇南京 210029；2.南京市江寧醫院檢驗科，江蘇南京 211100)

骨轉移是癌癥中晚期外源性惡性腫瘤轉移至骨組織引起的疾病，常伴隨骨痛和骨質損害[1-2]。隨著癌癥診療技術的發展，腫瘤患者生存周期明顯延長，骨轉移出現的概率也明顯增加，疾病的早期發現具有重要價值，可防范或減少錯誤治療，提高患者生存質量。目前，骨轉移輔助診斷主要依賴影像學技術(如放射核素骨掃描、X線和CT)，但缺點在于其特異度不能滿足臨床需求。而骨代謝相關的血清學標志物具有操作便捷、靈敏度高、動態監測的優點，受到臨床醫生及科研工作者的廣泛關注[3-5]，常見標志物如骨堿性磷酸酶(BALP)和抗酒石酸磷酸酶5b(TRACP 5b)。BALP是反映成骨細胞活性及功能的血清標志物，《肺癌骨轉移專家共識(2014版)》專門提到BALP在診斷和檢測骨轉移進展中的應用價值[6]。同時，應用中需要重視BALP檢測水平被低估，出現和臨床癥狀不相符的情況，進一步研究發現血清中均含有高水平尿酸(UA)。類似現象還見于筆者前期研究的血清標志物TRACP 5b，TRACP 5b是反映骨吸收代謝的重要血清標志物，在高水平UA條件下TRACP 5b水平受到抑制，出現假性降低的現象[7]。因此，本研究試圖通過構建BALP重組質粒，探究高水平UA是否干擾細胞系中BALP的產生及該影響因素產生的分子機制。

1 材料與方法

1.1標本來源 人骨肉瘤細胞(Saos-2細胞)、Hek293細胞、pGL3-basic質粒(對照質粒)、pRL-TK (海腎熒光素酶報告質粒)均源于南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部實驗室保存標本。DMEM培養基和限制性內切酶KpnⅠ、Bgl Ⅱ來自美國Thermo Fisher Scientific公司，胎牛血清和Opti-MEM培養基來自美國Gibco公司。大腸埃希菌DH5a、DL5000 Maker、TaKaRa Ex Taq保真酶和TDNA連接酶均購自大連TaKaRa寶生物公司。基因組DNA提取試劑盒、小量質粒抽提試劑盒、小量切膠回收試劑盒均購自美國Omega公司，瓊脂糖購自西班牙GENE公司。質粒轉染試劑LipofectamineTM2000 脂質體購自美國Invitrogen公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司，UA標準品購自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1人骨肉瘤細胞Saos-2細胞培養和細胞基因組DNA提取 液氮罐中取出Saos-2細胞凍存管，立即置于水浴箱中解凍復蘇。細胞培養液含10%的胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、DMEM培養基，置于37 ℃ 5%CO2細胞培養箱中培養。每天觀察細胞生長及融合情況，每周傳代培養兩次，保證實驗采用對數期生長細胞。通過胰蛋白酶消化處理收集細胞。用細胞基因組DNA提取試劑盒提取Saos-2細胞的DNA，所有步驟嚴格按照操作手冊進行，用分光光度計檢測評判DNA的水平和純度，—20 ℃保存備用。

1.2.2基因啟動子的預測和PCR引物設計 使用生物信息學方法借助NCBI基因數據庫和UCSC網站，獲取人BALP的全基因組序列：ALPL基因(編碼：NM_000478.4)，進一步預測啟動子序列位于ALPL基因的5′端上游區域，設計并合成一對引物用來擴增位于上游-473 bp至154 bp序列的片段(基因轉錄起始位點為+1位)。引物設計選擇Oligo7軟件，目的片段所含的Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ兩個酶切位點分析借助DNAMAN 5.2.9軟件，根據設計引物原則選擇評分最高的。上下游引物序列如下，F:5′-GGG GTA CCGTGC AGA GTC AGA GGT GCA CGT-3′(斜體下劃線是Kpn Ⅰ酶切位點)；R:5′-GAA GAT CTGAGC ACT GGC GAG GGT CCG TCC-3′ (斜體下劃線是Bgl Ⅱ酶切位點)。

1.2.3BALP基因5′側翼啟動子序列的PCR擴增 將提取的Saos-2細胞基因組作為DNA模板，根據5′端上游區域設計的引物進行PCR擴增，PCR反應條件設置為：94 ℃預變性5 min，1個循環；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR反應體系：雙蒸水37.75 μL，10×PCR緩沖液5.00 μL，dNTP混合液4.00 μL，上下游引物各1.00 μL，模板1.00 μL，TaKaRa Taq 0.25 μL。PCR 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。切下和目的基因大小相同的凝膠條帶，用DNA小量膠回收試劑盒對PCR擴增產物進行純化、回收。

1.2.4BALP基因啟動子熒光素酶報告基因重組質粒的克隆 用限制性內切酶Kpn Ⅰ酶和Bgl Ⅱ酶，將已純化的PCR產物和報告基因質粒PGL3-Basic分別進行雙酶切消化，反應條件為37 ℃，水浴酶切2 h。雙酶切后的目的基因擴增產物及載體質粒分別在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA小量膠回收試劑盒純化，再用T4 DNA連接酶把酶切純化后的PCR產物和載體質粒黏性末端進行連接，16 ℃水浴連接過夜。取10 μL連接產物加入至100 μL DH5α大腸埃希菌感受態細胞進行轉化，將上述懸液100 μL均勻地涂抹于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養板平板上，平板倒置于37 ℃恒溫培養箱過夜培養。次日挑取生長出來的菌落進行PCR驗證，PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，菌落的陽性克隆可見約620 bp大小的條帶，放大培養，陽性克隆并提取質粒，將BALP基因啟動子熒光素酶報告基因重組質粒命名為PGL3-BALP，構建重組質粒模式簡圖見圖1。

1.2.5不同水平UA溶液的配置 將40 mg UA干粉置室溫平衡，溶解在1 mol/L的NaOH溶液中，保證UA結晶顆粒充分溶解防止再次析出，若再次出現結晶時加熱溶解。取細胞培養液作為稀釋時的溶劑及空白對照品，留意調整pH值不宜偏酸。將UA溶液稀釋配置成0.2和0.4 mmol/L兩種水平備用。

1.2.6BALP基因5′側翼序列的啟動子活性初步鑒定 借助HEK293細胞進行質粒轉染，鑒定構建的重組質粒的啟動子活性。以每孔2×105個HEK293細胞鋪板于48孔板培養，次日細胞生長密度至80%～90%時進行轉染，每個質粒設置3個復孔。依據LipofectamineTM2000轉染試劑的使用說明書，對照質粒、待測重組質粒和內參照質粒pRL-TK進行瞬時共轉染。轉染24 h后去除每孔中的培養基，1×PBS輕輕洗滌細胞兩次，加入新鮮配制的1×被動裂解緩沖液裂解細胞。采用雙熒光素酶檢測試劑盒，分別進行待測重組質粒、對照質粒、內參質粒的熒光素酶活性檢測，計算熒光素酶活性的比值，即相對熒光素酶強度。

注：右側方框所示區域為雙酶切后插入目的片段區域，構建成新的重組質粒;Ampr為氨芐西林耐藥基因。

圖1 構建PGL3-BALP重組質粒模式簡圖

2 結 果

2.1BALP基因啟動子熒光素酶報告基因重組質粒的克隆 用Saos-2細胞基因組作為DNA模板，根據5′端上游區域設計的引物進行PCR擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果與目的條帶大小一致。將獲得的重組質粒進行雙酶切鑒定，利用Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ限制性內切酶，將雙酶切產物進行核酸電泳并觀察條帶分布。陽性克隆在單個泳道中顯示為兩個條帶：一條大小約5 000 bp(載體質粒片段)，另一條約620 bp(目的片段)，根據條帶位置可以判斷與目的片段相同，見圖2。將雙酶切鑒定為陽性克隆的質粒送外測序分析，將測序公司返回的結果序列輸入到在線BLAST核酸比對軟件，與ALPL基因的5側翼區的核酸序列比對結果相同。

注：1為pGL3-basic電泳圖，2為重組報告質粒雙酶切電泳圖，3為DL10000 DNA Maker。

圖2 BALP啟動子重組質粒酶切后電泳鑒定

注：加入0.4 mmol/L UA時的相對熒光素酶活性與加入0.2 mmol/L UA時比較，*P<0.05。

圖3 人BALP啟動子熒光素酶報告基因重組質粒在不同水平UA溶液中的相對熒光素酶活性比較

3 討 論

BALP來源于成骨細胞，排除了肝、腎、腸道等疾患的干擾，能更特異地反映骨代謝情況，當骨形成大于骨吸收時，血清中BALP活性明顯增高，是反映成骨細胞活性及骨形成的敏感指標之一[8]。骨是多種實體瘤的常見轉移部位，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌[9-10]，骨轉換標志物可應用在疾病的診斷、預后和預測過程中[11]。

隨著生活水平不斷提高，高尿酸血癥(HUA)患病率不斷增加，我國沿海經濟發達地區HUA的患病率超過10%[12-13]。2010-2015年江浙滬皖地區一項基于24家醫院的橫斷面研究發現，江蘇地區HUA檢出率達14.84%[14]。HUA還與惡性腫瘤的進展、轉移相關[15]，晚期腫瘤患者放、化療時會破壞細胞核，UA隨之釋放增多[16]。UA是嘌呤的終末代謝產物，可清除氧自由基，抑制氧化應激反應[17]，使骨細胞內抗氧化能力下降，降低反應骨代謝的相關標志物，抑制破骨細胞的生成[18]。國外研究嘗試在老鼠體內建立UA干擾破骨細胞的實驗模型，驗證UA可以降低破骨細胞內活性氧自由基(ROS)水平，進而影響破骨細胞生成，降低骨轉化相關標志物[19]。基于上述研究推測，在人體內可能也存在類似干擾，臨床監測患者的BALP需留意HUA的干擾。因此，本實驗借助細胞模型來驗證高水平UA影響BALP的生成，并探索其影響的機制。

在高水平UA對BALP啟動子的干擾實驗中，將UA最高水平設置為0.4 mmol/L，這是因為UA水平為0.8 mmol/L時，HEK293細胞的凋亡明顯增加，結果重復性差，不穩定。此外，國內學者在體外觀察不同水平UA對培養腎小管上皮細胞影響時也有類似發現，0.1 mmol/L UA溶液組(最低水平組)檢測腎小管上皮細胞凋亡率已經達到(73.4±11.7)%，且伴隨UA水平增加細胞凋亡率呈現劑量依賴性[20]。

本研究借助現有Saos-2細胞系成功構建了人BALP基因啟動子熒光素酶基因報告重組質粒，并驗證高水平UA對BALP基因啟動子活性產生抑制作用。下一步工作嘗試探索在其他人骨肉瘤細胞系中(如MG-63、U2SO)同樣的實驗過程能否具有共性的結論。此外在調控機制中，高水平UA是否作用于BALP基因啟動子中的轉錄因子結合位點而發揮作用，有待進一步研究。

4 結 論

本研究成功構建BALP基因啟動子重組質粒，證實高水平UA干擾Saos-2細胞系中BALP的產生。其干擾機制在于高水平UA抑制BALP基因啟動子的活性。BALP檢測在用于骨轉移的早期診斷、預后判斷等臨床應用時，應注意高水平UA造成的假陰性結果。