抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎患者中MIF及MCP-1的檢測及臨床意義*

張銘明，張 銳，楊小珂，帥宗文

(安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科，安徽合肥 230022)

抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關性血管炎(AASV)是一組由不同病因引起的血管炎癥性疾病，發病機制復雜，可能與免疫復合物介導的血管炎癥損傷及免疫調節機制有關，遺傳、感染及環境也是血管炎的致病因素。AASV可累及全身任何部位的大小血管及動靜脈血管，尤其對腎臟和肺受累最為常見，臨床表現復雜，變化多端，可呈隱匿性或急性發作，引起器官組織損傷。AASV最為明顯的特征是出現ANCA,這些特異性自身抗體的表達對AASV患者的某些臨床特點及相關臟器損傷具有一定的指示意義。巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)作為一種多功能免疫調節細胞，可以通過促進單核細胞趨化蛋白(MCP)-1的表達，在促炎、趨化、內皮細胞黏附等方面發揮重要作用[1-2]。為進一步探討這些細胞因子在AASV發病機制中所起的作用，筆者對其進行檢測并進行相關性分析，旨在幫助病情評估及預后判斷，為AASV患者的臨床監測治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集安徽醫科大學第一附屬醫院2017年1月至2019年5月風濕免疫科AASV住院患者84例為疾病組，其中男33例，女51例，年齡22～84歲，平均(67.64±12.23)歲。納入標準：(1)符合2012年美國查珀爾希爾共識會議(CHCC)系統性血管炎的分類診斷標準[3]者；(2)臨床資料真實詳細完整者；(3)既往無高血壓糖尿病者。排除標準：(1)不符合AASV的診斷標準者；(2)表現為ANCA陽性的急慢性感染、腫瘤、炎癥性腸病等患者；(3)臨床資料不完整者。健康對照組為體檢中心提供的60例體檢健康者，其中男19例，女41例，年齡16～68歲，患者均排除急慢性感染、風濕免疫性疾病及家族史，研究程序符合醫學倫理委員會制訂的倫理學標準并獲得批準，健康對照組與疾病組在年齡及性別構成上差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 MIF、MCP-1試劑盒由美國R&D Systems公司提供，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6試劑盒購自美國Biolegend公司，檢測均采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)；ANCA間接免疫熒光法和特異性自身抗體譜分析(化學發光法)檢測試劑盒分別由北京歐蒙公司和西班牙WerFen公司提供。全自動熒光分析儀型號為德國歐蒙公司Sptingter XL；全自身化學發光儀為西班牙WerFen Bioflash；熒光顯微鏡型號為日本Olympus BX51。

1.3標本的采集與檢測 采集所有研究對象外周血，1 000 r/min離心10 min以分離血清，-80 ℃保存標本，TNF-α、IL-6、MIF及MCP-1按照說明書進行，待測標本及標準品經加樣、酶標抗體、底物工作液、終止液、450 nm酶標儀檢測等ELISA步驟完成；ANCA 熒光以1∶10為起始稀釋度，按照說明書進行間接免疫熒光法檢測，將待測標本及質控品經加樣、熒光素標記抗體、封片、熒光顯微鏡半定量判讀，1∶10及以上判為陽性，陽性標本梯度稀釋繼續檢測。ANCA根據間接免疫熒光法熒光染色形態的不同分為核周型(p-ANCA)和胞漿型(c-ANCA)。ANCA特異性靶抗原髓過氧化物酶(MPO)和蛋白酶3(PR3)由化學發光法上機檢測；補體C3、C4、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)指標數據由醫院檢驗科生化室提供，紅細胞沉降率(ESR)數據由臨檢室提供。

2 結 果

2.1兩組血清中MIF及MCP-1水平比較 疾病組血清中MIF及MCP-1水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清中MIF及MCP-1水平比較

注：與健康對照組比較，aP<0.05。

2.2AASV高滴度ANCA患者與陰性及低滴度ANCA患者之間實驗室指標比較 高滴度ANCA患者與陰性及低滴度ANCA患者之間，MIF、MCP-1、TNF-α、IL-6、Cr、hs-CRP和MPO水平差異有統計學意義(P<0.01)，其他指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3AASV患者血清中MIF及MCP-1水平與臨床指標的相關性分析 AASV患者血清中MIF及MCP-1水平均與BUN、Cr、MPO、CRP、TNF-α、IL-6水平呈正相關(r=0.241～0.556，P<0.05),而與血清中C3、C4、ESR、PR3不相關(P>0.05)。見表3。

2.4AASV患者血清中MIF與MCP-1水平的相關性分析 AASV患者血清中MIF與MCP-1水平呈正相關(r=0.312,P=0.004)。見圖1。

表2 AASV高滴度ANCA患者與陰性及低滴度ANCA患者之間實驗室指標比較

組別nC3(g/L)C4(g/L)hs-CRP(mg/L)ESR(mm/h)MPOPR3高滴度ANCA540.95±0.220.22±0.068.42±5.92a32.80±16.4651.38±20.19a14.52±6.58陰性及低滴度ANCA300.89±0.250.21±0.075.94±2.1830.93±14.1432.23±14.246.58±2.17

注:與陰性及低滴度ANCA比較，aP<0.05。

表3 ANCA患者血清中MIF及MCP-1水平與臨床指標的相關性分析

圖1 AASV患者血清中MIF與MCP-1水平相關性散點圖

3 討 論

MIF是由多種細胞合成具有多效炎性介質功能的細胞調節因子，它既可以作為信號分子介導免疫調節功能，又可以通過自分泌和旁分泌方式進行自體和微循環調節。MIF在炎性疾病及代謝性疾病中發揮著重要作用，其通過與趨化因子(CXC)家族及CD74受體結合，以受體復合物(CXCR2/CD74、CXCR4/74)的形式，進行信號傳遞介導[4-6]。MCP-1是由多種細胞產生，趨化和激活各種免疫細胞，發揮促炎、趨化、內皮細胞黏附作用的可溶性堿性蛋白質趨化因子，MCP-1與CC類趨化因子受體2和4(CCR2、CCR4)結合形成受體復合物，誘導黏附分子VCMA-1和ICAM-1的表達，釋放多種炎性細胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等)，在炎癥性疾病及血管炎癥損傷修復中發揮重要的生物學作用[7-8]。因此，本研究旨在通過檢測AASV患者血清中MIF及MCP-1水平，分析其與臨床指標、疾病活動的關系及它們之間的關聯性來探討其在AASV疾病發展中的作用。

AASV是一種由不同病因引起的血管炎性疾病，在疾病的不同階段有炎性因子浸潤和抗原、免疫球蛋白及補體的沉積，侵犯機體的不同器官，尤其對腎、肺等器官造成致命性損傷。本研究發現，AASV患者血清中MIF及MCP-1水平較健康對照組明顯升高，而且在高滴度ANCA患者中尤其明顯。ANCA滴度與疾病活動及疾病復發存在明顯相關性，AASV患者經過積極對癥治療后ANCA滴度水平可下降，進一步說明MIF及MCP-1水平與疾病活動性相關。MIF主要由血管內皮細胞、T細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞等分泌，在炎性反應發生之前MIF就可以聚集在這些細胞中，誘導炎性反應產生后，MIF即被釋放出來[9]，與此同時，MIF的相關受體細胞CD74、補體CR2和補體CR4等也被分泌出來，形成受體復合物，進行信號傳導，誘導一系列炎癥因子(TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8等)的產生[5]。

AASV腎損傷通常表現為急進性腎炎，伴腎功能不全[10-11]。本研究發現高滴度ANCA患者與陰性及低滴度ANCA患者之間，Cr水平差異有統計學意義，表明高滴度ANCA患者腎受累嚴重，引起急進性腎炎，雖然腎活檢有助于明確AASV的鑒別診斷、病理特點、預后評判，但不是所有AASV患者都有腎活檢的適應證，因此，高滴度的ANCA及高特異性的MPO抗體水平對診斷AASV更有判斷價值。

本研究發現，MIF及MCP-1水平與AASV患者BUN、Cr、CRP、MPO、TNF-α、IL-6水平呈正相關，說明MIF及MCP-1水平升高可能誘導一系列炎癥因子的產生，參與AASV發病，促進疾病發展，導致腎功能的進一步損傷，說明MIF及MCP-1在加劇炎癥組織促炎細胞因子和趨化因子的表達中起到十分重要的作用，可作為炎癥活動的重要指標[7，12]。MIF和MCP-1不僅在炎癥發生、發展中起重要作用，還在內皮細胞激活修復、促進血管新生中起重要作用，在血管炎癥發生部位，能夠提高血管內皮細胞生長因子水平，促進血管內皮的活化[13-14]。本研究還發現MIF與MCP-1水平在AASV患者血清中呈正相關，筆者推測MIF一方面可能通過促進炎癥因子和趨化因子的表達，從而在炎癥微環境中發揮促炎作用；另一方面，一些炎癥介質和趨化因子受體復合物，如TNF-α、IL-6、MCP-1-CCR2/4等，通過核因子κB(NF-κB)激活蛋白系統反過來刺激單核巨噬細胞、T細胞、上皮細胞，促進MIF的表達[5]。這時，MIF作為這些炎癥介質的下游效應分子，形成正反饋效應，促進和放大局部的炎性反應，募集更多的炎癥細胞和趨化因子及復合物向炎癥部位浸潤，加速炎性反應的進展過程，如慢性腎臟血管炎癥性疾病的產生。

MIF有促炎細胞作用，相反，抗MIF抗體則有拮抗炎性細胞的作用，應用抗MIF抗體作用于炎性部位，會導致炎性因子(TNF-a、IL-1、IL-1β、IL-6等)水平的降低[15-16]。因此，為了深入探討MIF、MCP-1介導的AASV發病機制及其生物學功能，可溶性MIF、MCP-1蛋白的制備及抗MIF、MCP-1抗體拮抗劑的制備成為治療AASV新的發展方向。

4 結 論

MIF及MCP-1水平與AASV病情活動密切相關，推測這兩種蛋白水平的過度表達可能參與病情的發生、發展，MIF和MCP-1可能是監測疾病活動和調節自身免疫性炎癥疾病新的標志物。因此，關于如何抑制這兩種蛋白水平的表達，并將其抗體及受體拮抗劑應用于炎癥及免疫相關疾病治療的研究具有重要價值。