Vδ2 T細胞在2型糖尿病中的功能及臨床研究*

陳 康，傅 強，盧建強，王偉佳

(廣東省中山市人民醫院檢驗醫學中心，廣東中山 528403)

2型糖尿病是以血糖增高為特點的一種代謝紊亂性疾病。據報道，全國近5 000萬人患有2型糖尿病，且預測在22世紀患病人數可達到6 000多萬[1-2]。研究報道，初始免疫應答和適應性免疫應答參與2型糖尿病的發生、發展[3]。Vδ2 T細胞是具有抗原提呈功能，參與初始免疫應答的γδT細胞亞群，占γδT細胞的80%[4]。Vδ2 T細胞通過識別壞死細胞的非肽類抗原成分，釋放炎性因子如白細胞介素(IL)-17和干擾素-γ(IFN-γ)，激活初始CD4+T細胞和CD8+T細胞轉換為效應T細胞[5-7]。研究報道，Vδ2 T細胞可發揮感染免疫的作用[8-9]，參與脊柱關節炎的發生[10]，γδT細胞的數量在1型糖尿病患者體內降低，提示其與1型糖尿病的致病相關[11]。然而，Vδ2 T細胞在2型糖尿病中的作用尚不清楚。本研究旨在探討Vδ2 T細胞在2型糖尿病中的功能及與臨床指標的相關性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2019年6月來本院內分泌科就診的40例2型糖尿病患者作為2型糖尿病組，其中男25例、女15例，平均年齡(55.5±14.7)歲。2型糖尿病的診斷符合世界衛生組織頒布的診斷標準，且患者未合并其他疾病。排除標準：惡性腫瘤、自身免疫性疾病、急慢性感染、急性并發癥。收集同期本院體檢的健康體檢者35例為健康對照組，其中男16例、女19例，平均年齡(55.6±11.0)歲，兩組間性別和年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2流式細胞術檢測Vδ2 T細胞亞群的比例 采用密度梯度離心法分離所有研究對象單個核細胞，裂解紅細胞后，制備單個核細胞懸液，加入Pacific Blue標記的小鼠抗人CD3抗體(貨號：558124，美國BD公司)和FITC標記的小鼠抗人Vδ2 TCR流式抗體(貨號：562088，美國BD公司)，避光孵育30 min，FACSCanto Ⅱ進行流式檢測，FlowJo軟件進行結果分析。

1.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測Vδ2 T細胞IL-17和IFN-γ的分泌 收集所有研究對象的單個核細胞，采用CD4+陰性磁珠分離試劑盒(貨號：MAGH102，R&D 公司)去除CD4+T細胞，FACSAria流式分選出Vδ2 T細胞。將分選后的細胞鋪入細胞培養板中，加入50 ng/mL波醇酯(PMA，貨號：P1585，Sigma公司)和1 mg/mL離子霉素(ionomycin，貨號：407953，Sigma公司)刺激6 h，收集細胞培養上清液，采用ELISA檢測IL-17和IFN-γ的水平(貨號：D1700和DIF50，R&D公司)。

1.4空腹血糖、空腹C肽和糖化血紅蛋白的檢測 收集兩組的血清，采用西門子ADVIA2400生化分析儀檢測空腹血糖；采用西門子CENTAUR XP生化分析儀檢測空腹C肽的水平。收集兩組乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血采用BIO-RAD糖化血紅蛋白測定儀，檢測糖化血紅蛋白的水平。

1.5統計學處理 應用SPSS17.0統計分析軟件進行數據分析，采用非配對t檢驗的方法分析兩組之間的差異，采用Pearson進行相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組基本信息比較 2型糖尿病組中空腹血糖水平為(9.36±3.40)mmol/L，糖化血紅蛋白水平為(8.32±2.25)%，均高出參考值范圍；且2型糖尿病組的空腹血糖水平明顯高于健康對照組[(4.95±0.35)mmol/L]，差異有統計學意義(P<0.001)；糖化血紅蛋白水平明顯高于健康對照組[(4.78±0.34)%]，差異有統計學意義(P<0.001)。2型糖尿病組空腹C肽水平為(1.42±0.9)ng/mL，在參考值范圍內，但低于健康對照組[(1.76±0.38)ng/mL]，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：A為代表性的流式細胞術的結果；B為Vδ2 T細胞比例的統計分析；*表示P<0.001。

圖1 在2型糖尿病組和健康對照組中Vδ2 T細胞比例的差異

2.22型糖尿病組和健康對照組中Vδ2 T細胞比例的差異 結果顯示，2型糖尿病組中Vδ2 T細胞比例為(0.20±0.28)%，明顯低于健康對照組[(2.17±1.64)%]，差異有統計學意義(P<0.001)。以CD3標記淋巴細胞，Vδ2 TCR標記Vδ2 T細胞，流式細胞術的結果顯示，在2型糖尿病組和健康對照組中，CD3和Vδ2 TCR雙陽性細胞的比例分別為0.13%和3.20%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.3兩組Vδ2 T細胞分泌細胞因子的情況 結果發現，相較于健康對照組，2型糖尿病組中Vδ2 T細胞比例明顯下降，進一步用磁珠陰性分選法和流式細胞術分選法分選Vδ2 T細胞，用ELISA檢測細胞因子IL-17和IFN-γ水平時發現，2型糖尿病組中Vδ2 T細胞分泌的IL-17和IFN-γ水平均低于健康對照組，見圖2。

注：A為在2型糖尿病組和健康對照組中Vδ2 T細胞分泌IL-17的情況；B為在2型糖尿病組和健康對照組中Vδ2 T細胞分泌IFN-γ的情況；*表示P<0.01。

圖2 兩組Vδ2 T細胞分泌細胞因子的情況

2.4Vδ2 T細胞與空腹血糖、糖化血紅蛋白和空腹C肽相關性分析 相關性分析發現，Vδ2 T細胞比例與空腹血糖水平呈負相關(r=—0.411，P<0.01)；與糖化血紅蛋白水平呈負相關(r=—0.324，P<0.05)；進一步分析Vδ2 T細胞是否與患者的胰島β細胞的功能相關，結果發現Vδ2 T細胞比例與空腹C肽水平無相關性(r=0.062，P>0.05)。

3 討 論

2型糖尿病在全球普遍發病率高，且呈逐年增長的趨勢[1-2]。2型糖尿病患者免疫功能紊亂是疾病發生、發展的重要原因[3]。Vδ2 T細胞是一類具有抗原提呈功能的T細胞亞群，是初始免疫應答和適應性免疫應答的橋梁，可發揮抗感染的作用，也可參與疾病的發生[4-11]。然而，Vδ2 T細胞在2型糖尿病中的作用未知。本研究發現，Vδ2 T細胞在2型糖尿病患者中數量減少，其細胞因子釋放功能降低，且與空腹血糖和糖化血紅蛋白水平呈負相關(r=-0.411,-0.324;P<0.05)。

T細胞分為兩個主要的亞群，αβT細胞和γδT細胞。αβT細胞參與適應性免疫應答，主要包括CD4+T細胞和CD8+T細胞[12]。γδT細胞是初始免疫應答和適應性免疫應答的橋梁，其中Vδ2 T細胞占γδT細胞的80%[4]。研究報道，γδT細胞的數量在1型糖尿病患者體內降低，提示與1型糖尿病的致病相關[11]。在2型糖尿病中，T細胞的數量和功能紊亂，CD4+T細胞分化的促炎性的Th1細胞和Th17細胞以及抑炎性的Treg細胞和Th2細胞比例紊亂，導致患者系統炎癥和胰島素耐受[13-14]。CD8+T細胞通過誘導巨噬細胞的遷移促進疾病的發生[15]。而在2型糖尿病患者中Vδ2 T細胞的數量和功能如何變化鮮有報道。本研究發現在2型糖尿病患者中Vδ2 T細胞的數量減少，且其分泌的細胞因子IL-17和IFN-γ減少。研究報道，肥胖引起的慢性炎癥中，Vδ2 T細胞釋放的細胞因子IL-17減少，不能有效發揮抗感染的作用[16]。本研究發現，在2型糖尿病患者中Vδ2 T細胞數量減少，分泌的細胞因子IL-17和IFN-γ減少，這提示Vδ2 T細胞可能與2型糖尿病易于繼發感染有關。

作為抗原提呈細胞，Vδ2 T細胞可在非肥胖糖尿病小鼠動物模型中識別胰島素肽段B:9-23，釋放IL-17和IFN-γ，促進1型糖尿病發病[17-18]。空腹C肽是反映胰島β細胞功能的指標之一，相關性分析發現Vδ2 T細胞的比例與空腹C肽無相關性。這提示在2型糖尿病患者中Vδ2 T細胞數量與胰島β細胞功能無相關性，究其原因可能是Vδ2 T細胞減少不能發揮有效的自身抗體識別功能。同樣，本研究發現Vδ2 T細胞比例與空腹血糖和糖化血紅蛋白水平呈負相關，這提示Vδ2 T細胞可能與2型糖尿病血糖控制情況相關。

4 結 論

本研究檢測了2型糖尿病組和健康對照組Vδ2 T細胞的比例和功能并進行相關性分析，結果發現在2型糖尿病患者中Vδ2 T細胞比例減少，釋放的細胞因子減少，且與空腹血糖和糖化血紅蛋白水平呈負相關。