血培養中病原菌的耐藥性及耐碳青霉烯腸桿菌科細菌的耐藥基因研究*

彭 超，孟凌云，夏鵬程，薛慶節，陳 廷

(1.濟南大學/山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東濟南 250200；2.濟寧市第一人民醫院檢驗科，山東濟寧 272001；3.泰安市中心醫院檢驗科，山東泰安 271000；4.濟寧醫學院基礎學院，山東濟寧 272001)

隨著血培養技術在疾病的精準治療中發揮著越來越重要的作用，細菌培養鑒定和耐藥性分析也逐漸得到臨床重視。陽性標本中腸桿菌科細菌占據較高比例，而碳青霉烯類抗菌藥物，如亞胺培南、美羅培南和厄他培南，是臨床治療腸桿菌科細菌引起的感染最有效的抗菌藥物。但是，隨著碳青霉烯類抗菌藥物應用范圍及劑量頻繁加大，導致腸桿菌科碳青霉烯耐藥率呈現逐年上升趨勢[1]。眾所周知，耐碳青酶烯腸桿菌科細菌(CRE)耐藥機制復雜，在國內，腸桿菌科細菌的碳青霉烯酶基因分離率較高[2]，且耐藥菌株攜帶碳青霉烯酶基因主要為KPC和NDM-1。本研究對濟寧市第一人民醫院血培養陽性標本中病原菌的分布及耐藥性進行分析，并重點檢測CRE的耐藥基因，以便為臨床科學使用抗菌藥物提供強有力的理論指導，預防CRE多重耐藥菌株的產生及傳播。

1 材料與方法

1.1菌株來源 采用BD全自動血培養儀分離2017年12月至2018年12月9 258份臨床血培養標本中非重復病原菌共675株。

1.2儀器與試劑 美國BD全自動血培養儀Bactec FX，德國西門子公司MicroScan WalkAway 96 PLUS型全自動細菌鑒定分析儀，依據CLSI 2012年的標準判讀結果。試劑使用與儀器配套的相應培養基、鑒定卡。巧克力平板(鄭州安圖生物有限公司)，MH瓊脂培養基(英國Oxoid公司)，哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物有限公司)，E-test條(法國bioMerieux)，藥敏紙片(10 μg，英國Oxoid公司)，普通瓊脂糖(西班牙Biowest Agarose公司)，goldview核酸染料(北京世紀康為公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液(青島科尚生物公司)，Taq酶(青島科尚生物公司)。

1.3質控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞腸球菌ATCC29212、大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、銅綠假單胞菌ATCC27853和白色念珠菌ATCC66027均購自國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。

1.4方法

1.4.1細菌鑒定及藥敏試驗 參照《血培養檢測規范化操作》[3]進行標本的正確采集，并將其快速置于血培養儀中進行連續震蕩培養和檢測，儀器報警有陽性瓶時，取出后無菌操作抽取培養液，立即革蘭染色做初級報告，并快速轉種血平板、巧克力平板、麥康凱平板等進行五區劃線方式培養，待其菌落生長良好備用。采用德國西門子WalkAway 96 PLUS自動化微生物鑒定儀NC50復合板進行細菌鑒定及藥敏試驗。儀器未報警陽性，同時進行涂片顯微鏡檢查和培養，顯微鏡檢查可有效避免漏檢厭氧菌和苛養菌，若有細菌生長，則進一步行菌株鑒定。檢測方法分析性能驗證參照文獻[3-5]。

1.4.2耐碳青霉烯表型篩選方法 根據2018年美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)的更新，改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)用于檢測腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，而EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(eCIM)是與mCIM聯合使用以區分產金屬酶和絲氨酸碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。mCIM可以單獨進行實驗，但eCIM必須同時和mCIM聯合進行實驗。僅當mCIM結果呈陽性時，eCIM結果才有效。

1.4.3PCR檢測相關耐藥基因 PCR反應條件：滅菌雙蒸H2O 31.75 μL，緩沖液5.00 μL，dNTP 4.00 μL，引物F 2.00 μL，引物R 2.00 μL，Tap酶0.25 μL，模板5.00 μL；95 ℃預變性持續1 min→95 ℃變性持續45 s→57 ℃退火復性持續45 s→72 ℃延伸45 s(需要35個循環)→72 ℃延伸10 min結束。引物序列[6-7]見表1。

表1 PCR擴增引物序列

續表1 PCR擴增引物序列

1.5統計學處理 采用WHONET5.6軟件進行耐藥及分布統計分析。

2 結 果

2.1主要致病菌種類 675株陽性菌中，排在前3位的分別為大腸埃希菌161株(23.85%)、肺炎克雷伯菌55株(8.15%)、人葡萄球菌46株(6.81%)。見表2。

表2 血培養675株主要病原菌種類

2.2病原菌分布 革蘭陰性(G-)桿菌的分離率(58.00%)高于革蘭陽性(G+)桿菌(42.00%)。其中，189株(28.00%)來自重癥監護病房(ICU)，79株(11.70%)來自兒內科病房。見表3。

2.3抗菌藥物敏感試驗結果 161株大腸埃希菌對亞胺培南等16種抗菌藥物的敏感率為36.0%～99.4%，55株肺炎克雷伯菌對亞胺培南等16種抗菌藥物的敏感率為60.0%～98.2%。其中大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南及厄他培南3種碳青霉烯類抗菌藥物的敏感率較高，均在98.0%以上。見表4。

表3 血培養675株病原菌科室分布情況

表4 血培養主要G-桿菌藥物敏感性結果(%)

2.4耐碳青霉烯表型篩選結果 對675株非重復分離病原菌中2株CRE進行表型驗證，2株細菌mCIM均陽性，確定其均產碳青霉烯酶，其中大腸埃希菌eCIM陽性，產金屬酶；肺炎克雷伯菌eCIM陰性，產絲氨酸碳青霉烯酶。

2.5耐碳青霉烯基因檢測結果 通過PCR方法檢測其相關耐藥基因，并對其陽性基因進行測序，結果檢出1株產NDM-1型金屬酶和KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的大腸埃希菌及1株產KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。見表5。

表5 耐碳青霉烯酶相關基因PCR結果

注：+表示陽性；-表示陰性。

3 討 論

本研究結果顯示，2017年12月至2018年12月濟寧市第一人民醫院共送檢血培養標本9 258份中，檢出非重復病原菌675株，陽性率為7.3%，低于張紅霞等[8]報道的10.4%，這可能與標本送檢率、培養條件和地區差異有關。675株陽性菌中G-桿菌的分離率明顯高于G+桿菌，排在前3位的分別為大腸埃希菌161株(23.85%)、肺炎克雷伯菌55株(8.15%)、人葡萄球菌46株(6.81%)。由于濟寧市第一人民醫院G+桿菌比例較高，懷疑與標本的污染存在直接關系，凝固酶陰性葡萄球菌為血培養污染的主要細菌，血培養標本的污染也是不可忽視的重大問題，這就要求檢驗科人員結合C-反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A、降鈣素原、白細胞總數、中性粒細胞數及亞硝酸鹽等感染指標，對結果進行評估鑒定，降低誤診率。

血培養陽性標本多分布于感染高發科室，排在首位的是ICU(189株，28.00%)。ICU血培養陽性率高首先考慮其抗菌藥物使用問題，患者感染重，早期臨床醫生經驗用藥在所難免，但如果藥物應用不合理，極易導致患者菌群失調，使患者出現條件致病菌感染；其次ICU作為相對封閉的科室，加大了醫院內感染可能，盡管醫務人員嚴格執行手衛生等醫院內感染管理要求，也不能完全避免院內感染的可能；最后ICU的患者多數運用體外支持、導尿、插管等有創操作，增加了血流感染的概率。排在第2位的是兒內科病房(79株，11.70%)，究其原因包括：兒科患兒普遍年齡較小，抵抗力較差，屏障系統發育不完善，病原菌易經局部感染入血，造成血流感染；兒科病房重視血培養標本采集，發熱患兒入院后及時送檢標本，陽性率高。一般來說，臨床上對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的細菌比較少見，腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物有較高的敏感性，研究報道顯示醫院內感染G-桿菌中占比較多的是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等[9-10]。本研究中，G-桿菌陽性率前2位分別為大腸埃希菌(161株)及肺炎克雷伯菌(55株)，由此可見濟寧市第一人民醫院腸桿菌科細菌感染相對嚴重，與李華信等[11]報道的結果相似。其中，大腸埃希菌的抗菌藥物敏感率為36.0%～99.4%，對碳青霉烯類抗菌藥物敏感率(99.4%)高，這與北京協和醫院相似[12]。肺炎克雷伯菌的抗菌藥物敏感率為60.0%～98.2%，對碳青霉烯抗菌藥物敏感率高(98.2%)。本研究結果說明，濟寧市第一人民醫院目前大多數腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物敏感性較高，耐藥性相對較低。但值得注意的是院內已發現了2株CRE菌株，提示臨床應重視對CRE的分離和監測數據，并根據實驗室檢測結果合理選用抗菌藥物。

碳青霉烯酶可以水解大部分β-內酰胺酶，包括A類酶：NMC-A、IMI、SME(染色體介導)、KPC和GES(質粒介導)；B類酶：金屬酶和NDM-1；D類酶：OXA和KPC。腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性也是全球威脅臨床醫療的重大問題之一。本研究通過PCR法對耐碳青霉烯抗菌藥物的菌株進行碳青霉烯酶耐藥基因篩選，結果顯示分別為產NDM-1型金屬酶和KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的大腸埃希菌，以及產KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。NDM-1型金屬酶于2008年首次被發現[13]，可高效水解廣譜β-內酰胺類抗菌藥物，可由染色體、質粒或轉座子介導，其由質粒編碼，通過水平基因轉化結合到其他細菌中，導致細菌的耐藥性傳播[14]。KPC酶屬Ambler分類的A類，是一種由質粒介導的絲氨酸β-內酰胺酶，其利用絲氨酸殘基的活性，且自身具有廣泛的水解活性，可分解頭孢菌素類、β-內酰胺類、氨曲南和碳青霉烯類抗菌藥物[15]。抗菌藥物的選擇不僅使耐藥基因廣泛擴散，而且可促進耐藥基因變異，進而使耐藥性發生改變[16]。本課題組既往的試驗亦證實，與碳青霉烯酶相關的耐藥基因可以通過質粒在細菌之間傳遞，并且導致細菌耐藥性的變化[17]。本研究結果顯示，濟寧市第一人民醫院已經出現CRE，耐藥基因分型分析顯示其耐藥機制主要為攜帶NDM-1型金屬酶和KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶，然而是否存在耐藥基因的垂直傳播還有待進一步研究。

4 結 論

基于本研究分析結果，濟寧市第一人民醫院血流感染形勢不容樂觀，首次從院內血培養中發現CRE，并且基因測序明確證實其耐藥性是由碳青霉烯酶耐藥基因所致。為此需要嚴格地按照指南標準進行抗菌藥物的選擇，加強醫院內感染管理控制，重視細菌耐藥監測的必要性，創造安全、良好的就醫環境。