共聚焦超分辨率成像與SIM超分辨率成像在蒿草生物組織樣本熒光成像中的使用價值分析

吳偉全 王思捷 楊 騰 吳 平▲ 李元歌

1.廣東醫科大學附屬醫院臨床醫學研究中心，廣東湛江 524001；2.廣東醫科大學附屬醫院放射科，廣東湛江 524001

激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM）在生物組織樣本熒光成像相關研究中，是一種使用率非常高和功能非常強大的成像工具[1-3]。隨著激光掃描共聚焦顯微鏡的發展，新型的激光掃描共聚焦顯微鏡配有超分辨率成像模塊，可對生物組織樣本進行超分辨率熒光成像[4]。結構光照明顯微鏡（structured illumination microscopy，SIM）是一種新型的超分辨率顯微鏡，也可對生物組織樣本進行SIM超分辨率熒光成像[5-7]。但目前兩種新顯微鏡在超分辨率熒光成像相關對比研究較少，需深入分析研究。本實驗通過激光掃描共聚焦顯微鏡和結構光照明顯微鏡對蒿草組織樣本進行熒光成像，對共聚焦超分辨率成像與SIM超分辨率成像在生物組織樣本成像中的使用價值進行分析研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

激光掃描共聚焦顯微鏡為日本奧林巴斯公司的激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV3000， SN：7L88410），其配有奧林巴斯圖像超分辨率重構成像模塊（olympus super resolution， OSR）；結構光照明顯微鏡為日本尼康公司的N-SIM超分辨率顯微鏡（Nikon N-SIM， SN：600001）；樣本為德國Leica顯微鏡公司的DAPI染色、FITC染色及TRITC染色蒿草組織切片。

1.2 實驗分組及觀察指標

實驗分為三組：（1）使用激光掃描共聚焦顯微鏡對蒿草組織樣本共聚焦普通成像（10倍，20倍，60倍和100倍物鏡）；（2）使用激光掃描共聚焦顯微鏡的OSR超分辨率成像模塊對蒿草組織樣本超分辨率成像（100物鏡）；（3）使用尼康公司的N-SIM超分辨率顯微鏡對蒿草組織樣本超分辨率成像（100物鏡）。每組重復5次。觀察指標：圖像的清晰度；圖像的對比度；圖像的熒光強度和圖像顯示的樣本超微結構細節情況。

1.3 激光掃描共聚焦顯微鏡對蒿草組織樣本的共聚焦普通成像

分別使用激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV3000）的405nm、488nm和565nm激光激發蒿草組織樣本進行熒光共聚焦掃描普通成像。分辨率為1024×1024；掃描速度為300Hz；針孔大小為200μm；物鏡分別為10倍、20倍、60倍和100倍；掃描模式為xyz；放大倍數為1。樣本每張重復掃描5次。

1.4 激光掃描共聚焦顯微鏡的OSR超分辨率成像模塊對蒿草組織樣本共聚焦超分辨率成像

分別使用激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV3000）的405nm、488nm和565nm激光激發蒿草組織樣本的熒光。物鏡為100倍。啟動OSR超分辨率成像模塊的超分辨率成像掃描模式進行成像。樣本每張重復掃描5次。

1.5 N-SIM超分辨率顯微鏡對蒿草組織樣本的超分辨率成像

分別使用尼康N-SIM超分辨率顯微鏡（Nikon N-SIM）的405nm、488nm和565nm的激光激發蒿草組織樣本的熒光。物鏡為100倍。啟動N-SIM超分辨率掃描模式進行成像。樣本每張重復掃描5次。

1.6 統計學方法

各組熒光圖像熒光強度值由軟件LAS X3.0采集，數據資料經SPSS17.0統計軟件進行分析，計量數值用（x±s）表示，采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 共聚焦顯微鏡掃描樣本得到的共聚焦普通圖像

圖1A，1B，1C和1D分別為激光掃描共聚焦顯微鏡掃描蒿草組織樣本得到的10倍，20倍、60倍和100倍圖像，圖像經過不同倍數的放大，顯示不同倍數的組織樣本局部結構，共聚焦圖像具有清晰度較高的特點。

圖1 激光掃描共聚焦顯微鏡掃描蒿草組織樣本得到的共聚焦普通圖像注：A為10倍共聚焦圖像； B為20倍共聚焦圖像；C為60倍共聚焦圖像； D為100倍共聚焦圖像

2.2 共聚焦顯微鏡和N-SIM超分辨率顯微鏡分別掃描樣本得到的超分辨率圖像

圖2 A為激光掃描共聚焦顯微鏡的OSR超分辨率成像模塊使用100倍物鏡掃描蒿草組織樣本得到的共聚焦超分辨率圖像[由405nm的激光激發樣本，DAPI染色的藍色熒光的熒光值為（25.31±0.33）AU；由 488nm的激光激發樣本，FITC染色的綠色熒光的熒光值為（19.38±0.19）AU；由565nm的激光激發樣本，TRITC染色的紅色熒光的熒光值為（0.57±0.05）AU]。圖2B為N-SIM超分辨率顯微鏡使用100倍物鏡掃描蒿草組織樣本得到的超分辨率圖像[由405nm的激光激發樣本，DAPI染色的藍色熒光的熒光值為（17.73±0.15）AU；由488nm的激光激發樣本，FITC染色的綠色熒光的熒光值為（14.22±0.07）AU；由 565nm的激光激發樣本，TRITC染色的紅色熒光的熒光值為（13.69±0.16）AU]。相同倍數不同染料染色熒光圖像熒光強度統計比較分析，熒光強度值有統計學意義（P＜0.05）。見表1。共聚焦超分辨率圖像具有清晰度較高，色彩對比度明顯的特點，而SIM超分辨率圖像具有顯示組織樣本局部的超微結構細節更加突出的特點（見圖2B中箭頭指示部分）。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡和N-SIM超分辨率顯微鏡分別掃描蒿草組織樣本得到的超分辨率圖像注：A為共聚焦超分辨率圖像； B為SIM超分辨率圖像

表1 兩組蒿草樣本不同染料染色熒光圖像熒光強度值比較（x ± s，AU）

3 討論

激光掃描共聚焦顯微鏡作為新一代顯微鏡，在生物組織樣本熒光成像領域發揮重大的作用，可掃描生物組織樣本得到高清晰度的熒光圖像[8-9]。研究表明激光掃描共聚焦顯微鏡可對生物組織樣本熒光成像，而且熒光圖像清晰度高，是生物組織樣本熒光成像的重要工具[10-11]。本實驗使用激光掃描共聚焦顯微鏡對蒿草組織樣本進行10倍、20倍、60倍和100倍熒光成像，共聚焦圖像可顯示不同倍數的組織樣本局部結構，同樣具有清晰度較高的特點。

生物組織樣本的超高分辨率熒光成像在研究中越來越重要，其有助于觀察分析組織樣本局部的超微結構。新型的激光掃描共聚焦顯微鏡配有超分辨率成像模塊，采用圖像超分辨率重構（Super Resolution，SR）新技術，其原理是使用多張低分辨率圖像進行計算機分析處理得出高分辨率圖像的圖像重構技術，去獲取組織樣本的超分辨率圖像[12-13]。本實驗使用新型共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV3000）的超分辨率成像模塊掃描蒿草組織樣本，可得到高清晰度的共聚焦超分辨率圖像。

隨著超分辨率顯微鏡的不斷發展，結構光照明顯微鏡作為一種新型的超分辨率顯微鏡，采用結構光照明顯微成像新技術（SIM），其原理是通過讓多重相互衍射的光束照射到樣本上，再從收集到的發射光中獲得高分辨率相關信息，經計算機分析處理，最終獲得高分辨率圖像，可對生物組織樣本進行超分辨率熒光成像[14-16]。本實驗使用N-SIM超分辨率顯微鏡掃描蒿草組織樣本，可獲取其SIM超分辨率圖像。

本實驗分析對比結果表明激光掃描共聚焦顯微鏡和結構光照明顯微鏡均可對生物組織樣本進行超分辨率成像。共聚焦超分辨率成像圖像清晰度較高，色彩對比度明顯，而SIM超分辨率成像具有顯示組織樣本局部的超微結構細節更加突出的特點。作為新型成像工具，它們在生物組織樣本超分辨率成像中，均有重要的使用價值。