b型流感嗜血桿菌莢膜多糖提取新工藝中Triton X-114殘留含量的質量標準研究

朱文勇 歐陽圣潔 代小虎 宋紹輝 寸怡娜 陳 楓 廖國陽

中國醫學科學院醫學生物學研究所，云南昆明 650118

b型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzaetype b,Hib）為莢膜型致病菌，可導致敗血癥、會厭炎、肺炎、腦膜炎等多種侵襲性疾病[1-3]。接種Hib結合疫苗是目前預防其感染的最有效途徑[4]。Hib莢膜多糖是其最主要的毒力因子[5]和免疫抗原[6]，現在上市的Hib結合疫苗，莢膜多糖的提取均采用傳統工藝[7]，其中使用大量的苯酚，嚴重影響操作者的身體健康，破壞生態環境。為此，國內外開展了Hib莢膜多糖提取新工藝的研究[8-13]，其中利用Triton X-114進行多糖純化的新工藝，具有安全環保、成本低廉、線性放大好等優點，同時也有相關研究[14-15]將Triton X-114應用于生物制品成品生產工藝過程中。同時，新工藝提取的多糖與載體蛋白進行結合后的原液穩定性研究也初步顯示了良好的應用潛力[16]，因此，有望將該工藝投入到實際生產中。而對于其在莢膜多糖中的殘留控制則影響著疫苗產品的質量安全，目前在《中國藥典》中并沒有關于Triton X-114的檢測方法，但已有文獻[17]根據Triton X-100的檢測方法建立了Triton X-114的檢測方法，而其在Hib莢膜多糖中殘留含量的質量標準尚無相關研究。本文通過對苯酚法應用于Hib莢膜多糖中Triton X-114殘留含量檢測的可行性進行驗證，并對多批次的檢測數據進行統計，結合安全性評價結果初步制定出Hib莢膜多糖中Triton X-114殘留量的質量控制標準。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Varioskan Flash全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司）；苯酚（西隴化工有限公司）；Triton X-114（美國Sigma公司）。Hib莢膜多糖由中國醫學科學院醫學生物學研究所生物制品五室制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 線性范圍的驗證 分別配制10.00、20.00、40.00、60.00、70.00mg/L TritonX-114 溶液，按照文獻[17]中的方法測定TritonX-114與苯酚發生反應后產物在340nm波長處的A值，確定線性范圍。每個稀釋度測定3次，計算每個稀釋度的3個測定值之間的相對標準偏差（RSD）值，RSD值應≤5%。標準曲線的R2應≥0.99。

1.2.2 準確性和精密性驗證 配制低（10.00mg/L）、中（30.00mg/L）、高（60.00mg/L）濃 度 的 TritonX-114溶液，同時每個濃度設置對應添加終濃度為5.00g/L Hib莢膜多糖（由傳統方法制備）的對照組，按照文獻[14]中的方法進行檢測，每個濃度樣品平行測定3組，重復測定3次，計算回收率和RSD值，驗證方法的準確性和精密性，要求回收率的范圍應為90%～110%，RSD值應≤5%。

1.2.3 樣品檢測及異常毒性試驗 新工藝提取的15批Hib莢膜多糖中Triton X-114的檢測按照文獻[17]中的方法，其每mL體積的含量與多糖含量的比值即為Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量。異常毒性實驗按照2015年《中國藥典》三部中通則1141法進行檢測。

2 結果

2.1 線性范圍的驗證結果

從10.00～70.00mg/L的5個濃度檢測結果（表1）顯示其RSD值均小于5%，表明在10.00～70.00mg/L的范圍內可以用該方法檢測。同時利用該值做線性回歸，其回歸方程為Y=0.0107X-0.0056，R2=1.00，說明其線性關系成立，且相關性較好。

表1 測定范圍結果

2.2 準確性和精密性驗證結果

低、中、高濃度情況下，含Hib莢膜多糖與否并不影響Triton X-114的檢測結果，并且回收率均在95%～105%，說明該方法準確度良好，而其RSD值均＜5%，說明該方法精密度較好。見表2～ 3。

表2 標準品的準確度、精密度檢測結果

表3 含Hib莢膜多糖標準品的準確度、精密度檢測結果

2.3 樣品檢測及異常毒性試驗

不同批次間Triton X-114的殘留含量并不完全一致，但異常毒性的檢測結果均符合安全性要求（表4）。殘留含量平均值為15.04mg/g莢膜多糖，這15批間的標準差為4.58，根據統計學規律，其殘留量上限應為15.04+2×4.58=24.20mg/g莢膜多糖，結合異常毒性的檢測結果，初步把Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量質量標準的上限定為25.00mg/g莢膜多糖。

表4 新工藝提取Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量及其異常毒性檢測結果

3 討論

隨著社會的發展、生活水平的提高，人們對疫苗質量及對環境保護要求越來越高，病原菌莢膜多糖的提取工藝不斷改進，新的化學試劑也隨之引入。Triton X-114是一種常用化學試劑，已廣泛應用于微量金屬物富集檢測、生物大分子的分離與純化及環境樣品的前處理中[18-20]。但Triton X-114尚未在《中國藥典》生物制品中正式出現，而其類似物Triton X-100則已應用于上市生物制品中。在其檢測方法被建立的基礎上，通過本實驗驗證了該方法也可以應用于Hib莢膜多糖中的Triton X-114殘留含量的檢測。

Triton X-114與Triton X-100類似都屬于非離子表面活性劑，毒性較小，但殘留含量在《中國藥典》尚無明確質控標準，如后續工藝所需引入該物質，仍需對其殘留量進行質量監控。本實驗通過對多批新工藝制備的Hib莢膜多糖的Triton X-114進行檢測，在保證安全性的前提下，經統計初步制定出Hib莢膜多糖中Triton X-114的殘留含量質量標準的上限定為25.00mg/g莢膜多糖。該標準下疫苗的Triton X-114殘留含量不高于0.76μg/mL，與之類似的Triton X-100的質控標準在重組乙型肝炎疫苗中為＜15.00μg/mL，而在流感病毒裂解疫苗中的質控標準為＜300.00μg/mL。因此，本實驗制定的Triton X-114殘留含量質控標準能夠達到生物制品的安全性要求，該標準可以為后續Triton X-114在《中國藥典》中殘留含量的質控標準的制定提供參考依據。