加入芍藥苷的乳鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、纖維化及TGF-β1mRNA和Smad3 mRNA表達(dá)觀察

帥壯，唐鍇，劉茂，艾嬌，馮杰，陳劍

1川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川南充 637000；2 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；3中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院

心肌纖維化和心臟重構(gòu)與多種心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)，而心臟成纖維細(xì)胞(CFbs)在其中發(fā)揮重要作用生理狀態(tài)下，CFbs可以通過(guò)控制細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解來(lái)修復(fù)受損心肌[1]。病理狀態(tài)下機(jī)械或化學(xué)刺激可促進(jìn)CFbs的遷移、增殖和分化，從而分泌過(guò)多的膠原纖維，促進(jìn)心臟纖維化或心肌瘢痕的形成和進(jìn)展[1，2]。因此，如何減輕或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，已成為慢性心力衰竭(CHF)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。免疫炎癥激活是CHF和心肌纖維化的重要因素[3,4]。因此，近年來(lái)各國(guó)學(xué)者積極探索抗炎和免疫調(diào)節(jié)治療的療效和安全性，其有望為CHF的治療帶來(lái)新的希望。芍藥苷(PF)是一個(gè)單萜類糖苷化合物，是傳統(tǒng)中藥芍藥的主要活性成分。PF具有多種生物活性，如免疫抑制、抗炎和減少癌細(xì)胞擴(kuò)散等。此外,PF可以改善肝、腎纖維化[5，6],并可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖[7]。我們前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，PF同樣具有抗心肌細(xì)胞纖維化的作用，在本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步探索PF對(duì)CFbs增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 原代Wistar乳鼠CFbs購(gòu)自CHI科技公司(江陰，No20140520HXM)。芍藥苷(純度>98%)購(gòu)于金穗生物科技公司(上海)，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)(純度>98%)購(gòu)于美侖生物科技公司(大連)，MTT試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒、羥脯胺酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)于建成生物有限公司(南京)，TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司(美國(guó))，qPCR試劑盒購(gòu)于GeneCopoeia公司(美國(guó))，qPCR檢測(cè)儀采用EPPENDORF(德國(guó))，流式細(xì)胞儀采用BECKMAN COULTER(美國(guó))。

1.2 CFbs細(xì)胞分組及CF干預(yù)方法 將原代CFbs細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)液，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h更換培養(yǎng)液。當(dāng)CFbs布滿瓶底時(shí)進(jìn)行傳代。選擇第2～3代CFbs分為4組，h陰性對(duì)照組(CON)僅加入普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，AngⅡ組(ANG)組在培養(yǎng)液中加入 10-7mol/L的Ang Ⅱ，低劑量PF組(PF-L)在 培養(yǎng)液中加入10-7mol/L的 Ang Ⅱ和10 μmol/L的PF高劑量PF組(PF-H)在培養(yǎng)液中加入 10-7mol/L的Ang Ⅱ和100 μmol/L的PF。各組細(xì)胞均于5% CO2、37 ℃中培養(yǎng)48 h，備用。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將5×MTT用稀釋液稀釋成1×MTT溶液；每孔加入50 μL 1×MTT溶液，37 ℃、飽和濕度、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；棄上清液，每孔加入150 μL的 DMSO，平板搖床搖勻；用酶標(biāo)儀在630 nm處檢測(cè)每孔光密度(OD)值；每孔的校正OD值等于各測(cè)試孔的OD值減去空白孔OD值，各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)。測(cè)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(加藥組細(xì)胞OD值/對(duì)照組細(xì)胞OD值)×100%。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞羥脯胺酸(HYP)檢測(cè) 培養(yǎng)72 h時(shí),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，嚴(yán)格按羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組細(xì)胞HYP含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞儀。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，每組收集1～5×105個(gè)細(xì)胞；每管加入結(jié)合液 500 μL，輕輕混勻；加入Annexinn V-FITC 5 μL，輕輕混勻；加入碘化吡啶5 μL染色混勻，20 ℃～25 ℃避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexinn V-FITC為綠色熒光，碘化吡啶為紅色熒光；用CXP 2.0軟件獲取及分析數(shù)據(jù)。測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)(早期凋亡+晚期凋亡)/細(xì)胞總數(shù)×100%。重復(fù) 3 次，取平均值。

1.6 各組細(xì)胞TGF-β1、Smad3 mRNA檢測(cè) 采用qPCR法。取各組細(xì)胞，加入1 mL TRIzol，吹打混勻，室溫放置5 min；加入200 μL氯仿，振蕩混勻30 s，室溫靜置15 min；4 ℃下12 000 g離心15 min,吸取上層水相至無(wú)RNase 離心管；加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻，室溫靜置10 min；4 ℃下，12 000 g離心10 min，棄上清，收集RNA沉淀；加入75%乙醇，振蕩懸浮沉淀，4 ℃下，8 000 g離心5 min，棄上清風(fēng)干；加入60 μL DEPC水溶解沉淀，萃取CFbs細(xì)胞總RNA；利用All-in-One試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，內(nèi)參選用β-actin。引物序列如下: TGF-β1(F) 5′-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3′, TGF-β1(R) 5′-TGGTTGTAGAGGGCAAG GAC-3′, Smad3(F) 5′-GGCAGGATGTTTCCAGCTA-3′,Smad3(R) 5′-GCAGTCC ACAGACCATGTCA-3′, β-actin(F) 5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′, β-actin (R) 5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。以2-ΔΔCT值代表目的基因相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD值比較 ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組細(xì)胞OD值分別為0.348±0.065、 0.076±0.009、0.084±0.009、0.193±0.025 ，與CON組比較，ANG組細(xì)胞OD值升高；與ANG組比較，PF-L組及PF-H組OD值降低(P均<0.05)。鏡下可見(jiàn)，CON組CFbs細(xì)胞貼壁良好，排列整齊有序。與CON組相比，ANG組CFbs貼壁緊密，顯著增殖，排列不規(guī)則。與CON組相比，PF-L組和PF-H組CFbs細(xì)胞數(shù)量顯著減少，可見(jiàn)少許死亡細(xì)胞漂浮。見(jiàn)圖1。

注：A為CON組；B為ANG組；C為PF-L組；D為PF-H組

2.2 各組細(xì)胞HYP含量比較 ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組細(xì)胞HYP含量分別為(1.432±0.536)、(0.399±0.287)、(0.600±0.201)、(1.132±0.499)μg/mL,與CON組比較，ANG組細(xì)胞HYP含量升高(P<0.05)，與ANG組比較，PF-H組細(xì)胞HYP含量降低(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組細(xì)胞凋亡率分別為1.136±0.525、1.088±0.547、2.521±0.251、3.437±0.612，與ANG組比較，PF-L組、PF-H組細(xì)胞凋亡率升高(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞TGF-β1、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 ANG組、PF-H組、PF-L組TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.364±0.123、0.166±0.049、0.536±0.098，與CON組比較，ANG組TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)，與ANG組比較，PF-H組TGF-β1mRNA相對(duì)表量降低(P<0.05)。ANG組、CON組、PF-H組、PF-L組Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.528±0.138、0.156±0.03、0.489±0.054，與CON組比較，ANG組Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)，與ANG組比較，PF-H組Smad3 mRNA相對(duì)表量降低(P<0.05)。

3 討論

心肌纖維化主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，可導(dǎo)致心肌組織缺血缺氧，降低心室壁順應(yīng)性以及收縮功能，促使心功能減退[1,3,9]。心肌纖維化涉及腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、炎癥因子、生長(zhǎng)因子TGF-β等多種因素的參與[3,9]。AngⅡ可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原沉積，從而引起心肌纖維化[10]。本研究采用AngⅡ來(lái)誘導(dǎo)心肌增殖。HYP是膠原組織的主要成分之一，是膠原中特有的氨基酸成分，約占膠原氨基酸總量的13%，其表達(dá)水平可間接反映心肌膠原的含量，在本研究中，我們通過(guò)對(duì)各組HYP含量進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估PF對(duì)CFbs膠原分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AngⅡ誘導(dǎo)的CFbs的HYP含量顯著高于正常組，PF-H組HYP含量較低，表明PF可抑制CFbs的膠原分泌。

研究[8]發(fā)現(xiàn)，PF可改善心肌重塑，但發(fā)揮這一作用的具體機(jī)制尚不清楚。在本研究中，通過(guò)在AngⅡ培養(yǎng)的CFbs模型中加入不同濃度的PF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組及ANG組相比，PF組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且這一作用與PF成劑量依賴性。表明PF具有抑制CFbs的增殖、促進(jìn)其凋亡的作用。李健哲等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PF具有抗纖維化的作用，且PF濃度越高，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞增殖活性及膠原含量越低。由于我們并未單獨(dú)設(shè)立PF組，因此我們并不清楚PF是否對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡起著直接調(diào)控作用。但李健哲等[11]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用PF處理的成纖維細(xì)胞，其細(xì)胞數(shù)及膠原含量無(wú)明顯變化，由此我們可以推斷，PF是通過(guò)調(diào)節(jié)某種體液因子間接調(diào)控心肌纖維化，由于AngⅡ是一種重要的促纖維化因子，因此我們認(rèn)為PF的抗纖維化作用可能是由于其阻斷了AngⅡ的促纖維化作用。

既往研究[10,12,13]發(fā)現(xiàn)，AngⅡ通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)因子TGF-β表達(dá)，參與了心肌纖維化的過(guò)程。TGF-β的激活促使心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，并抑制膠原的降解從而導(dǎo)致心肌纖維化進(jìn)行性加重,在心臟重構(gòu)和纖維化中扮演著重要的作用[9,14,15]。在哺乳動(dòng)物中，TGF-β存在三種形式：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，以TGF-β1為主[15]。Smads是TGF-β1信號(hào)通路中下游主要效應(yīng)分子，包括受體激活型Smads(R-Smads)如Smadl、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，共同通路型Smads(Co-Smads)如Smad4，抑制型Smads(Ⅰ-Smads)如Smad6、Smad7。R-Smads主要參與纖維化的過(guò)程，Co-Smads是TGF-β必要的信號(hào)中轉(zhuǎn)分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起承接作用，Smad4不會(huì)直接與受體發(fā)生相互作用，但是能直接與DNA結(jié)合來(lái)調(diào)控有關(guān)基因的表達(dá),而Smad7作為負(fù)性調(diào)控因子，可競(jìng)爭(zhēng)性的與TGF-β1受體結(jié)合形成受體復(fù)合物，阻斷TGF-β1的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)，從而抑制纖維化的發(fā)生[15]。TGF-β通過(guò)與Ⅰ和Ⅱ型TGF-β受體結(jié)合，激活下游Smad2/3信號(hào)通路，促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，并抑制膠原的降解從而導(dǎo)致心肌纖維化進(jìn)行性加重[9]，此外，TGF-β也參與了其他促纖維化細(xì)胞因子的合成和分泌[9]，共同促進(jìn)了心臟纖維化的發(fā)生。本研究中，AngⅡ可上調(diào)TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)。加入PF可抑制CFbs增殖、凋亡，抑制HYP表達(dá)，其可能機(jī)制為PF抑制細(xì)胞TGF-β1及Smad3 mRNA表達(dá)。相反，PF則阻斷了AngⅡ的這一作用，抑制了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的表達(dá)，且PF濃度越高，對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的抑制越明顯。因此，我們認(rèn)為，PF可能是通過(guò)抑制AngⅡ促進(jìn)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)揮了抑制CFbs的增殖的作用。

綜上所述，PF可通過(guò)抑制CFbs的增殖、促進(jìn)CFbs凋亡、抑制CFbs膠原的分泌,達(dá)到抗纖維化的目的，這一作用與抑制AngⅡ?qū)GF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，但是否通過(guò)其他分子影響了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的表達(dá)或影響了其他Smad分子尚不清楚,有待于進(jìn)一步研究。