抗真菌肽MAF-1A體外對近平滑念珠菌生物膜形成能力的影響、與生物膜結合及抑菌情況觀察

成榮，李紅凌，胡方芳，許強,3，羅振華,3，李偉

1貴州大學醫學院，貴陽 550025；2 貴州省人民醫院；3 國家衛生健康委員會肺臟免疫性疾病診治重點實驗室；4 貴州醫科大學附屬醫院

近平滑念珠菌是一種機會性真菌感染病原體，是第二或第三臨床常見的真菌感染病原體[1]。近平滑念珠菌的致病性與多個毒力因子的影響密切相關，如黏附于人體組織、器官和植入性的醫療器械，分泌各種裂解酶(蛋白酶，磷脂酶和溶血素)，可表型轉換，形成生物膜及逃避免疫系統攻擊等[2,3]，其中生物膜的形成被認為是近平滑念珠菌一個重要的毒力因子。生物膜是由菌體在其分泌的細胞外基質內包裹中形成的致密結構，與病原體的耐藥性形成密切相關，生物膜相關感染性疾病的治療難度增大[4,5]。發達國家多種醫院感染性疾病的發生與生物膜形成有關，如心內膜炎、骨髓炎、鼻竇炎、尿路感染、慢性前列腺炎、牙周炎等[6,7]。因此，為有效防治與生物膜形成相關的感染性疾病，研發新的藥物具有重要意義?？咕木哂幸种粕锬ば?、破壞生物膜結構及殺死生物膜內細胞的能力?？咕膆LF 1-11是人源N-端乳鐵蛋白衍生肽，Roberta等[8]研究發現，hLF1 -11可通過顯著降低生物膜細胞密度和代謝活性，下調生物膜形成相關基因CpALS7、 CpACE2、 CpEFG1等的表達，抑制近平滑念珠菌生物膜的形成。MAF-1(Musca domestica antifungal peptide -1)是經免疫誘導后從家蠅(Musca domestica)幼蟲血淋巴中分離得到的一個新型抗真菌肽[9]。MAF-1A是MAF-1碳端α螺旋功能結構域第128-153位26個氨基酸肽段[10]。我們前期研究[11]發現，MAF-1A對多種常見致病性念珠菌均表現出一定的抗菌活性。本研究通過體外培養形成近平滑念珠菌生物膜，觀察不同濃度MAF-1A對近平滑念珠菌生物膜形成及對生物膜細胞活性強弱的影響，了解MAF-1A對近平滑念珠菌的抗菌作用特點，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及儀器 近平滑念珠菌標準株ATCC22019，近平滑念珠菌臨床株F1356、F983、F668由貴州省人民醫院中心實驗室于-80 ℃保存?？拐婢腗AF-1A及其熒光標記衍生肽FITC-MAF-1A均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，使用分析型高效液相色譜(HPLC)鑒定其純度>95%，行ESI質譜檢測，確認多肽序列正確。主要試劑：沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)，沙氏葡萄糖液體培養基(SDB)購于北京索萊寶科技有限公司，氟康唑(FLC)購于美國Sigma公司，細胞活性檢測試劑盒XTT Assay Kit (ab232856) 購于英國Abcam公司。

1.2 MAF-1A的體外抗真菌活性觀察

1.2.1 不同稀釋濃度SDB培養基的選擇 將經SDA平板活化的ATCC22019菌體適量重懸于SDB、1/2SDB、1/4SDB、1/8SDB、1/16SDB、1/32SDB培養基中，每孔200 μL加入無菌96孔板中35 ℃恒溫培養24 h后檢測OD490nm值。SDB、1/2SDB、1/4SDB、1/8SDB、1/16SDB、1/32SDB培養基中ATCC22019的OD490nm分別為0.160±0.005、0.162±0.008、0.161±0.006、0.119±0.002、0.052±0.003、0.045±0.001，SDB、1/2SDB、1/4SDB培養基中ATCC22019的OD490nm組間相比差異無統計學意義，說明SDB、1/2SDB、1/4SDB濃度培養基未影響ATCC22019生長。

1.2.2 MAF-1A最低抑菌濃度(MIC)測定 參考臨床和實驗室標準研究所(CLSI)M27-A3測定MAF-1A的抗真菌活性。取活化的ATCC22019菌落重懸于SDB、1/2SDB、1/4SDB培養基中，濃度調至1～5×103CFU/mL。加入不同濃度MAF-1A(0.1、0.2、0.3 、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0 mg/mL)，無MAF-1A處理的菌懸液為生長對照，培養基為空白對照孔，另選擇0.1 mg/mL的FLC為藥物對照。經35 ℃恒溫培養24 h，測定吸光度OD490nm值，最低抑菌濃度(MIC)值[12]：真菌生長百分率=(各孔OD490nm值-空白對照孔OD490nm 值)/(生長對照孔OD490nm值-空白對照孔OD490nm值)×100%；真菌生長抑制百分數=(1-真菌生長百分數)×100%。取真菌生長抑制百分數≥80%的最低藥物濃度為MIC值。結果發現，1/4SDB培養基中MAF-1A能更好的發揮抗ATCC22019菌活性，其MIC值為0.3 mg/mL。

1.3 不同濃度MAF-1A對近平滑念珠菌生物膜形成的影響觀察

1.3.1 生物膜形成菌株選擇 取-80 ℃保存的F668、F983、F1356、ATCC22019接種于SDA平板上，35 ℃恒溫培養24 h復蘇菌株，挑取直徑>5 mm的單菌落于1/4SDB中混勻為菌懸液，調整濃度2×106CFU/mL，100 μL/孔加入到取聚苯乙烯無菌96孔板中,37 ℃培養24 h，無菌PBS緩沖液(PH=7.2～7.4)清洗3遍將未附著的菌體洗下并檢測OD490nm值。實驗設置3個生物學重復。根據如下判定方法判定菌株生物膜形成能力[13]：OD490nm<0.03，無生物膜形成能力；0.03≤OD490nm<0.08，生物膜形成能力弱；0.08≤OD490nm<0.16生物膜形成能力一般；OD490nm>0.16，生物膜形成能力強[13]。F668、F983、F1356、ATCC2201的OD490nm分別為0.002±0、0.032±0.02、0.133±0.007、0.004±0.004，F1356具有體外生物膜形成能力，F668、F983、ATCC2201均無體外生物膜形成能力。鏡下可見體外培養時，F1356形成的生物膜菌體密度高且連接緊密，形成較致密的結構。因此本研究后續以該菌所形成的生物膜進行有關近平滑念珠菌生物膜相關的實驗研究。

1.3.2 不同濃度MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力檢測 取F1356菌體適量于1/4SDB中，調整菌液濃度為2×106CFU/mL，100 μL/孔加入到無菌聚苯乙烯96孔板中，37 ℃恒溫培養24 h，PBS清洗3遍，將F1356分為5份，每份3個復孔，其中四份分別加入100 μL濃度為0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A 使其，加入無菌水者為空白對照。另將F1356分為5份，每份3個復孔，其中4份分別加入0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC，加入無菌水者為空白對照。37 ℃培養24 h，PBS清洗3遍，Synergy H1微孔板檢測儀檢測OD490nm值，以OD490nm值代表MAF-1A、FLC處理的F1356生物膜形成能力。重復3次，取平均值。并于倒置顯微鏡下觀察F1356生物膜中的菌體密度及膜致密結構。

1.3.3 MAF-1A與F1356生物膜結合情況觀察 采用熒光標記技術。體外培養F1356使其形成生物膜，培養方法同“1.3.1”。在培養液中加入0.6 mg/mL的 FITC-MAF-1A培養，分別于培養1、3、6、12、24 h時取共培養液，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下(藍光激發)觀察MAF-1A與F1356生物膜的結合情況。熒光標記的衍生肽FITC-MAF-1A可與F1356生物膜結合并進入生物膜內，鏡下可觀察到黃綠色熒光信號。

1.3.3 不同濃度 MAF-1A處理的F1356生物膜細胞活性強弱檢測 采用XTT細胞活性檢測技術。將F1356菌體分為5份，每份3個復孔，其中4份分別加入100 μL濃度為0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A 使其，加入無菌水者為空白對照。37 ℃培養24 h，PBS清洗3遍，按照XTT Assay Kit (ab232856) 試劑盒操作說明檢測F1356生物膜內細胞活性。Synergy H1微孔板檢測儀檢測OD450nm值，以OD450nm代表F1356生物膜的細胞活性。實驗中全程閉光操作。重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 不同濃度MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力比較 0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力分別為0.156±0.011、0.071±0.007、0.025±0.003、0.007±0.002，空白對照孔為0.163±0.009，與空白對照比較，0.6、0.9、1.2 mg/mL的 MAF-1A處理的F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05)。0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜形成能力分別為0.144±0.008、0.073±0.007、0.023±0.005、0.004±0.002，空白對照孔為0.144±0.008，與空白對照比較，0.6、0.9、1.2 mg/mL的 FLC處理后F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05)。

鏡下可見與對照組相比，0.6、0.9、1.2 mg/mL的MAF-1A處理的F1356生物膜中菌體密度減少，膜致密結構被破壞；與對照組相比，0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC處理的F1356生物膜中菌體密度減少，膜致密結構被破壞。見圖1。

注：A, F為空白對照；B為0.3 mg/mL MAF-1A 處理的F1356；C為0.6 mg/mL MAF-1A 處理的F1356；D為0.9 mg/mL MAF-1A處理的F1356；E為1.2 mg/mL MAF-1A 處理的F1356；G為0.3 mg/mL FLC 處理的F1356；H為0.6 mg/mL FLC 處理的F1356；I為 0.9 mg/mL FLC 處理的F1356；J為 1.2 mg/mL FLC 處理的F1356。

2.2 MAF-1A與F1356生物膜的結合情況 隨培養時間延長，鏡下可見黃綠色熒光信號逐漸增多，培養24 h時可觀察到生物膜內存在大量黃綠色熒光信號。見圖2。

圖2 培養1、3、6、12、24 h MAF-1A與近平滑念珠生物膜的結合情況

2.3 不同濃度MAF-1A處理的F1356生物膜細胞活性比較 0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL MAF-1A處理的F1356生物膜活性分別為0.873±0.031、0.655±0.029、0.535±0.038、0.471±0.017，空白對照孔為1.268±0.167，隨MAF-1A濃度增加，F1356生物膜細胞活性逐漸降低(P均≤0.05)。0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜活性分別為0.841±0.061、0.845±0.050、0.894±0.036、0.982±0.056，空白對照孔為1.368±0.144，與對照組比較，0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜活性降低(P均≤0.05)，與0.3 mg/mL FLC比較，0.9、1.2 mg/mL FLC處理的F1356生物膜活性升高(P均≤0.05)。

3 討論

近平滑念珠菌的感染率增加與其易黏附于固體材料表面及易在導管等醫用材料上形成生物膜密切相關[14]，生物膜形成后對常用抗真菌藥物敏感性大大降低[15]。我們發現，MAF-1A在0.6 mg/mL濃度下即可抑制近平滑念珠菌生物膜的形成。隨藥物劑量及作用時間的增加，MAF-1A抑制近平滑念珠菌生物膜形成作用增強，提示MAF-1A對生物膜形成具有較好的抑制作用，其作為抗生物膜藥物開發資源具有重要研究價值。

目前生物膜的耐藥性機制尚不明確。有研究[16]報道，近平滑念珠菌生物膜內菌體生長結構發生變化，菌絲相的菌體所占比例增加，同時，生物膜內細胞代謝較游離狀態的細胞增加，這些變化可能有利于其對抗真菌藥物產生耐受。關于生物膜的耐藥機制研究中，抗菌藥物的滲透障礙被認為是生物膜耐藥性產生的主要原因之一[17]。研究[18,19]發現，抗菌藥物不能有效的結合并進入膜內，從而使抗菌藥物作用效果減弱。相較于游離狀態的菌體，生物膜菌體連接緊密，密度高，尤其是生物膜形成的特殊細胞外基質，主要成分為水不溶性的胞外多糖，極大阻礙了抗菌藥物進入生物膜發揮抗菌效應。我們通過固相合成抗真菌肽MAF-1A的熒光標記衍生肽(FITC-MAF-1A)，并將FITC-MAF-1A與F1356生物膜共同孵育不同時間后在熒光顯微鏡下觀察發現，隨著作用時間的延長，越來越多的MAF-1A結合于F1356生物膜，并在膜內聚集，這提示我們，MAF-1A與F1356生物膜具有較好親和性，能透過生物膜進入膜內。我們推測，這可能與抗菌肽本質為蛋白質，與生物膜的親和性較其他類型的藥物要高，這是其可應用于抗生物膜藥物研發資源的一大優勢。有研究報道，生物膜細胞活性增加，代謝活性增強，使得生物膜對抗菌藥物的適應性，代謝等能力增強。這可能是導致生物膜耐藥性較高的原因之一。在我們的研究中，MAF-1A作用下F1356生物膜細胞活性降低，隨著多肽濃度的增加細胞活性逐漸降低。結合熒光顯微鏡觀察結果，MAF-1A可結合并逐漸聚集于生物膜細胞內，推測隨著作用時間延長，進入生物膜細胞內MAF-1A通過破壞細胞膜、胞內細胞器等結構，紊亂細胞正常的代謝反應，從而影響細胞活力。MAF-1A具有較好的抗生物膜特性，可作為抗生物膜藥物研發對象。

綜上所述，MAF-1A可抑制F1356的生物膜形成，且MAF-1A可與F1356生物膜結合進入生物膜內，抑制F1356生物膜的細胞活性，可作為抗生物膜藥物研發對象，值得我們進行更為深入的研究。