Breg Tfh Tfr細胞在免疫性血小板減少癥患者中的表達及意義

梁興林 夏瑞祥 曾慶曙 楊明珍 李慶生

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP) 是一種免疫介導的血小板過度破壞所致的出血性疾病[1]。B細胞在免疫系統中執行多重功能，包括遞呈抗原、分泌抗體和各種細胞因子等。調節性B細胞(regulatory B cell,Breg) 是一類具有免疫抑制功能的B細胞亞群，參與維持機體免疫穩態，并且在各種免疫病理過程中發揮著重要調節作用。濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cell,Tfh)為新近發現的效應性T細胞亞群，是輔助生發中心B細胞產生抗體的主要細胞[2]，其作用可被濾泡調節性T細胞(follicular regulatory T cell,Tfr)所抑制[3]。多種自身免疫性疾病的發生與Tfr細胞分化不足、Tfh細胞數量增多及Tfr/Tfh失衡有關[4-5]。研究[6]顯示，Breg細胞通過分泌白介素-10(interleukin-10,IL-10)調控著Tfh細胞和Tfr 細胞在二級淋巴器官的分化和遷移。本文通過流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測ITP中Breg、Tfh、Tfr細胞的表達水平，探討Breg、Tfh、Tfr在ITP發病機制中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年10月至2019年10月安徽醫科大學第一附屬醫院收治的初次診斷的30例ITP患者為ITP組，所有患者均符合中國《原發免疫性血小板減少癥診斷與治療專家共識(2016年版)》診斷標準，其中，女性19例，男性11例，年齡16～76歲，平均(36.25±11.62)歲。選擇同期健康體檢者25例作為健康對照組，其中，女性15例，男性10例，年齡18～68歲，平均(38.21±15.37)歲。兩組對象一般資料進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入研究對象均排除具有藥物過敏史、自身免疫性疾病及糖皮質激素應用史等。

1.2 檢測試劑 Breg相關流式單抗CD19-PECy7、CD24-PE、CD38-FITC、IL-10-APC和Tfh/Tfr相關流式單抗CD4-FITC、CXCR5-PE、ICOS-710、Foxp3-APC均購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集和處理 治療前，取兩組對象靜脈血5 mL，肝素抗凝。應用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

1.3.2 FCM檢測外周血Breg細胞 取已分離的PBMC，加入培養液，5%CO2培養箱中培養4 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌，加入熒光標記的CD19-PECy7、CD24-PE和CD38-FITC單抗，避光染色30 min，PBS洗滌后，加固定液，避光保存30 min，PBS洗滌后，加入破膜劑和IL-10-APC，避光胞內染色20 min，PBS洗滌后，上流式細胞儀(FACSCanto,BD公司)檢測，CD19+CD24hiCD38hi細胞群為Breg細胞，CD19+CD24hiCD38hiIL-10+就是分泌IL-10的Breg細胞。

1.3.3 FCM檢測外周血中Tfh和Tfr 細胞 取已分離的PBMC，分別加入熒光標記的CD4-FITC、CXCR5-PE和ICOS-710單抗，避光孵育30 min，加入固定液，避光保存30 min， PBS洗滌離心后，加入破膜劑和Foxp3-APC，避光胞內染色20 min，PBS洗滌后，上流式細胞儀檢測，CD4+CXCR5+ICOS+細胞群為Tfh細胞，CD4+Foxp3+CXCR5+ICOS+細胞群為Tfr 細胞。

1.4 觀察指標 采集兩組對象外周血進行FCM檢測，應用FlowJo V10.0軟件分析，測定Breg細胞、分泌IL-10的Breg細胞、Tfh細胞和Tfr細胞的百分比，并計算Tfr/Tfh的比值。

2 結果

2.1 外周血Breg細胞表達水平、IL-10+Breg細胞比例比較 ITP組患者外周血CD19+B細胞中，Breg細胞表達水平、IL-10+Breg的比例均低于健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 兩組對象外周血Breg表達水平、IL-10+ Breg細胞比例比較

圖1 兩組研究對象Breg與IL-10+ Breg的FCM檢測結果

2.2 外周血Tfh、Tfr 細胞表達水平及Tfr/Tfh比較 ITP組患者外周血CD4+T細胞中Tfh細胞表達水平高于健康對照組，Tfr細胞表達水平低于健康對照組，Tfr/Tfh低于健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 兩組對象外周血Tfh、Tfr 細胞表達水平及Tfr/Tfh比較

圖2 兩組研究對象Tfh與Tfr的FCM檢測結果

3 討論

ITP發病機制尚未完全明確，研究[7-8]顯示，B淋巴細胞分泌的血小板自身抗體是ITP的主要發病原因，結合自身抗體的血小板最終被機體的單核吞噬細胞系統所清除，從而導致外周血血小板減少。闡明血小板自身抗體產生的調控機制，對明確ITP的發病機理及治療有重要的意義。本文通過FCM檢測Breg、Tfh、Tfr細胞在ITP患者中的表達，探討Breg、Tfh、Tfr在ITP發病機制中的作用。

邊緣區來源的Breg細胞通過分泌IL-10和轉化生長因子-β控制初始T細胞向Tfh、Tfr 細胞的分化[9]。有研究[10]顯示，ITP患者體內Breg細胞表達明顯下降，其分泌IL-10的功能也隨之降低，抑制單核細胞活化的能力受損。狄正霞等[11]研究發現，ITP組患者血清Breg細胞表達水平較健康對照組低，初診ITP組IL-10 mRNA水平較健康對照組明顯減低，治療后其IL-10 mRNA水平較治療前顯著升高。本研究結果發現，初診成人ITP患者對比健康對照組，外周血Breg細胞數量和IL-10+Breg細胞比例下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，與上述結果相同。Breg細胞水平的下降可導致Tfh和Tfr細胞比例失衡。

B淋巴細胞的活化及分化需要Th細胞提供第二信號及分泌細胞因子，Th細胞在體液免疫中具有重要作用，但Th細胞的本質一直未明確。研究[4]發現，Tfh細胞在生發中心與B細胞相互作用，并主要通過分泌多種細胞因子來調控B細胞的增殖分化、Ig類型轉換和抗體親和力成熟。Tfr 細胞表面同時高表達Treg細胞相關分子和Tfh細胞相關分子，在功能上，Tfr 細胞具有Tfh細胞及Treg細胞的雙重特性，可以調節Tfh數目、控制生發中心的反應、防止自身反應性B細胞產生。研究[12]發現，Graves病、SLE、風濕性關節炎、重癥肌無力等多種自身免疫性疾病患者外周血存在Tfh和Tfr 細胞數量異常。在兒童ITP患者體內發現，Tfr 細胞和Tfr/Tfh明顯減低，且與外周血血小板計數呈正相關[13]。本研究結果顯示，ITP患者外周血Tfh細胞水平比健康對照組升高，而Tfr細胞出現下降，Tfr/Tfh降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。成人ITP患者Breg細胞數量及IL-10+Breg細胞比例下降，引起Tfh和Tfr細胞比例失衡，可以進一步影響B淋巴細胞分化成熟異常及血小板自身抗體的產生，最終導致患者血小板減少。

綜上所述，ITP患者外周血Breg細胞減少，IL-10分泌降低，造成Tfr/Tfh比例失衡，從而影響B細胞的分化增殖，最終導致血小板抗體分泌過多，這可能是ITP發病機制之一。深入研究ITP患者Breg、Tfh和Tfr細胞相互作用的調控機制，對闡明ITP的發病機制和提供新的治療思路有重要的意義。